От чего повышается гемоглобин: О чем расскажет анализ крови на гемоглобин

У подростков зашкаливает гемоглобин | .

Но медики не уверены, что это хорошо

Мы привыкли считать, что проблемы из-за гемоглобина могут быть лишь в том случае, когда его уровень низок. Такая ситуация чревата развитием анемии со всеми вытекающими последствиями – слабость, сонливость, головокружение (вплоть до обмороков), постоянные простуды. Между тем, опасным для здоровья может быть не только снижение, но и повышение уровня гемоглобина выше нормы.

Каждый третий – «рекордсмен»
Гемоглобин – та составляющая крови, которая отвечает за снабжение всех наших органов и тканей кислородом. Казалось бы, чем гемоглобина в крови больше, тем лучше. Но на самом деле это не так. Как главный терапевт Минздрава Крыма, главврач Республиканского кардиологического диспансера Йонас Игнатонис объяснил «Газете», что в некоторых случаях слишком высокий уровень гемоглобина может говорить лишь о том, что организм таким образом приспосабливается к не самым подходящим условиям жизни. К примеру, у людей, живущих или работающих в сильно загазованных районах, где кислорода в атмосферном воздухе меньше и «добывать» его сложнее, уровень гемоглобина, как правило, повышен. Повышается уровень гемоглобина и при серьезных болезнях легких, при бронхиальной астме, при нарушении функций щитовидной железы. Но независимо от причины, следствием повышенного уровня гемоглобина становится увеличение вязкости крови. А чем гуще кровь, тем выше риск образования тромба, соответственно тем выше риск инфаркта или инсульта. Традиционно считается, что особенно опасен высокий гемоглобин в пожилом возрасте, а у молодых людей сердце и сосуды крепче, да и гемоглобин, если и отклоняется от нормы, то скорее в сторону уменьшения. Но в последние годы медики наблюдают удивительную тенденцию.

– Сейчас чуть ли не у каждого третьего-четвертого подростка уровень гемоглобина повышен до 170-178 грамм на литр (при верхней предельной норме 170 г/л для мужчин и 160 г/л для женщин). Причем, такая ситуация наблюдается не только у нас, а во всем мире. И сколько-нибудь вразумительного объяснения наука этому явлению пока не нашла. Возможно, дело в акселерации, возможно – в ухудшении экологической обстановки, изменении образа жизни, но как бы то ни было факт остается фактом. И чем такие «рекорды» могут аукнуться в будущем, пока неизвестно, – рассказал «Газете» Йонас Пилипович.

Меньше металла
Тем, у кого уровень гемоглобина высок, стоит придерживаться определенных правил питания. Прежде всего – ограничить продукты, содержащие железо. Считается, что наиболее богата железом говяжья печень. Это действительно так – содержание железа в ней выше, чем в мясе. Однако усваивается «печеночное» железо хуже, поэтому самым главным поставщиком железа все же является телятина, на втором месте – говядина и свинина. При высоком уровне гемоглобина мясное (если уж сильно хочется) лучше есть на завтрак, а не на ужин – в первой половине дня железо хуже усваивается. И не подавать к мясным блюдам овощи, богатые витамином С (например, лук или квашеную капусту) – аскорбиновая кислота способствует усвоению железа.

Также при высоком уровне гемоглобина нужно уменьшить потребление животных жиров – они повышают уровень холестерина, а с ним и риск образования бляшек в сосудах, сужение их просвета, что при густой крови особенно опасно. Стоит ограничить и употребление сахара и продуктов, его содержащих – тортов, шоколада и конфет. Хотя в сладостях и мало железа, но в кишечнике они создают благоприятную среду для всасывания его из пищи.

При повышенном уровне гемоглобина очень полезны любая рыба и морепродукты (креветки, морская капуста), поскольку в них много жирных кислот, которые делают кровь менее вязкой, и йода, укрепляющего стенки сосудов, – вместе они снижают риск образования тромба.

Гадание по ладони
При низком уровне гемоглобина (ниже 120-90 г/л), то есть при анемии, человек чувствует невероятную слабость, у него может наблюдаться одышка, боль в области сердца типа стенокардии, шум в ушах, мелькание «мушек» перед глазами. Удивительно, но сходные симптомы могут возникать и если уровень гемоглобина выше нормы. А специфическим признаком дефицита железа является извращение вкуса – у человека появляется пристрастие к неприятным запахам (бензин, ацетон), желание есть несъедобные вещества (мел, известь). Особые признаки повышенного уровня гемоглобина – покраснение кожи и белков глаз, бессонница.

Попробовать определить, выше или ниже нормы уровень гемоглобина, можно, взглянув на линии на внутренней стороне ладони (те, по которым гадают). Если они бледные, почти белые – велика вероятность анемии, если напротив, темнее общего фона – уровень гемоглобина в норме или повышен. Впрочем, окончательный и действительно точный ответ может дать только анализ крови.

Самые «железные» продукты

При повышенном гемоглобине их нужно избегать, а при пониженном – наоборот, почаще включать в меню.

1. Красное мясо – телятина, говядина, свинина.
2. Говяжья, свиная, утиная печень.
3. Яичный желток.
4.Овсяная крупа из необработанного овса (цельная овсянка).
5. Гречневая крупа, чечевица.
6. Фасоль, особенно красная.
7. Свекла.

Парадокс курильщика

Как ни странно, но у настоящего курильщика уровень гемоглобина всегда в норме. Однако этот гемоглобин не справляется со своей работой – соединяясь с моноокисью углерода, содержащейся в сигаретах, он теряет способность переносить кислород. Так что у курильщика может быть образцово-показательный уровень гемоглобина – и при этом анемия. Поэтому курящим не стоит полагаться на результаты обычного клинического анализа, а обязательно нужно проводить более серьезное комплексное обследование.

Диагностика, скрининг и оценка компенсации сахарного диабета

Диагностика,  скрининг  и оценка компенсации сахарного диабета.

Гликированный гемоглобин (HbA1c) – специфическое соединение гемоглобина эритроцитов с глюкозой, концентрация которого отражает среднее содержание глюкозы в крови за период около трёх месяцев.

Подготовка к исследовани:

1. Не принимать пищу в течение 2-3 часов до сдачи крови, можно пить чистую негазированную воду.

2.  Исключить физическое и эмоциональное перенапряжение и не курить в течение 30 минут до исследования.

Подготовка  к исследованию : натощак.

Материал: венозная кровь.

Метод исследования: Иммуноингибирование.

Реагенты: Biomedical USA.

Единицы измерения:  % (процент).

Срок выполнения анализа: 1 рабочий день.

Референсные значения: 4 – 6,2 %.

Чем ближе уровень А1с к 7 % у пациента, страдающего диабетом, тем легче контролировать болезнь. Соответственно, с повышением уровня гликированного гемоглобина повышается и риск осложнений.

Результаты анализа на А1с интерпретируются следующим образом.

Тема 1. Что такое сахарный диабет?

Основные вопросы:
Определение и понятие СД.
Нормальные цифры глюкозы крови.
Глюкоза в моче.
Гликированный гемоглобин и фруктозамины.
С-пептид и другие анализы.

Сахарный диабет – это группа заболеваний, при которых хронически повышается уровень глюкозы крови. В норме уровень глюкозы крови поддерживается натощак от 3,3 до 5,5; после еды – до 7,8 ммоль/л.

Существуют другие единицы измерения глюкозы крови: мг/дл. Чтобы перевести в ммоль/л надо показатель в мг/дл разделить на 18.

В организме уровень глюкозы крови снижает гормон инсулин, который вырабатывается в поджелудочной железе.

Если инсулина вырабатывается мало, или он не вырабатывается совсем, или вырабатывается некачественный инсулин, или человеку удалили поджелудочную железу и др., уровень глюкозы в крови повышается и человеку ставится диагноз «сахарный диабет».

В зависимости от причины заболевания устанавливается тип диабета (1 тип, 2 тип, панкреатогенный и др.).

При 1 типе диабета инсулин не вырабатывается совсем или его вырабатывается очень мало.

При 2 типе сахарного диабета на начальном этапе заболевания инсулин может вырабатываться даже в избыточном количестве, однако действие его ослаблено (из-за снижения чувствительности организма к инсулину или «некачественного» инсулина).

При панкреатогенном диабете инсулин не вырабатывается после перенесенного панкреатита или удаления поджелудочной железы.

Это самые распространенные типы сахарного диабета, но не все.

Отдельным состоянием является гестационный сахарный диабет, который развивается у беременных женщин и проходит после беременности.

Итог один: высокий уровень глюкозы крови.            

Чем отличаются диабет 1 и 2 типов?

1 тип диабета чаще развивается у молодых людей, чаще всего это аутоиммунное заболевание. Симптомы диабета часто появляются внезапно (жажда, сухость во рту, выделение большого количества мочи, резкое похудение). Однако при этом погибло уже более 90% бета-клеток поджелудочной железы. Лечится данный тип диабета только инсулином.

2 тип развивается у лиц более старшего возраста (хотя в последнее время все больше молодых людей с диабетом 2 типа), людей с избыточной массой тела, ожирением. Часто развивается без всяких симптомов и поэтому поздно выявляется. Для своевременной диагностики диабета 2 типа проводится скрининговое исследование на глюкозу людей из групп риска. Лечится диабет 2 типа диетой, нормализацией массы тела  и таблетками, т.к. в начале заболевания инсулин вырабатывается. Но в дальнейшем наступает истощение поджелудочной железы, инсулин перестает вырабатываться и тогда назначается инсулин.

Иногда возникают  ситуации, когда сложно определить, какой у человека тип диабета. Например, существует сахарный диабет 1 типа с медленно прогрессирующим течением, когда заболевание выявляется в более зрелом возрасте, но у пациента нет ожирения и сразу требуется назначение инсулина.

На основании чего устанавливается диагноз «Сахарный диабет»?

Сахарный диабет устанавливается на основании измерения уровня глюкозы крови.       Верхняя граница нормального уровня глюкозы в крови из пальца натощак 5,5 ммоль/л, в крови из вены – 6,0 ммоль/л.

Если уровень  глюкозы натощак ≥ 6,1 ммоль/л в крови из пальца, или ≥ 7,0 ммоль/л в крови из вены, или  после еды  ≥ 11,1 ммоль/л в любой крови устанавливается диагноз сахарный диабет.

Следует обратить внимание, что, хотя при определении глюкозы крови глюкометром кровь берется из пальца, но большинство современных глюкометров откалибровано по плазме, поэтому при определении глюкозы крови глюкометром следует ориентироваться на показатели для плазмы.

Уровень глюкозы крови натощак в крови из пальца от 5,6 до 6,0 ммоль/л (в крови из  вены от 6,1 до 6,9 ммоль/л) является промежуточным состоянием между нормой и сахарным диабетом («преддиабет»).

Термин «преддиабет» используется в качестве неофициального названия.

Официальное название  данного состояния включает два диагноза: «нарушенная толерантность к глюкозе» и «нарушенная гликемия натощак».

Для уточнения данных состояний пациенту может назначаться  тест с глюкозой. НО! Если уровень глюкозы натощак ≥ 6,1 ммоль/л в крови из пальца, или ≥ 7,0 ммоль/л в крови из вены, или  после еды  ≥ 11,1 ммоль/л – ТЕСТ С ГЛЮКОЗОЙ ПРОВОДИТЬ НЕ НАДО!

Очень важным показателем является  гликированный гемоглобин. Гликированный гемоглобин показывает, какой был средний уровень глюкозы крови за последние 3 месяца.

Глюкоза крови связывается с гемоглобином, который содержится  в эритроците (эритроцит является инсулинНЕзависимой клеткой крови). Когда в крови много глюкозы, то она в большем количестве связывается с гемоглобином. Эритроцит живет 120 дней, поэтому гликированный гемоглобин  показывает, какой был средний уровень глюкозы крови за последние 3 месяца.     

Нормальным является уровень гликированного гемоглобина до 5,7-6,0%. Уровень гликированного гемоглобина  ≥6,5% является критерием для установления диагноза «сахарный диабет». 

При уровне гликированного гемоглобина 5,7-6,4% можно говорить о «преддиабете» (при отсутствии критериев диагностики сахарного диабета по уровню глюкозы крови).

Гликированный гемоглобин применяется не только в качестве критерия диагностики сахарного диабета, но и в качестве критерия компенсации сахарного диабета (оценка компенсации за последние 3-4 месяца).

Для оценки компенсации за последние 3 недели назначается анализ на фруктозамины.

Глюкоза в моче. В норме в моче нет глюкозы, т.к. при образовании мочи почки реабсорбируют всю глюкозу. Глюкоза в моче появляется, когда уровень глюкозы в крови превышает определенный уровень (почечный порог) и почки не могут реабсорбировать всю глюкозу. «Почечный порог» для глюкозы крови составляет 8-10 ммоль/л. Т.е. когда глюкоза в крови выше этого уровня, почки начинают пропускать глюкозу в мочу. Если в моче есть глюкоза, значит в тот промежуток времени, в течение которого в мочевом пузыре собиралась эта порция мочи, уровень глюкозы крови превышал почечный порог. Если Вы утром измерили глюкозу крови и она 5 ммоль/л, но в моче есть глюкоза, значит, ночью уровень глюкозы был высоким.

Для оценки секреции инсулина поджелудочной железой можно определять  иммунореактивный инсулин в крови и С-пептид.

Если человек получает инсулинотерапию, то иммунореактивный инсулин покажет ложное значение, поэтому в таких случаях определяется только С-пептид. С-пептид – это часть молекулы инсулина.

С-пептид показывает, сколько инсулина продуцирует поджелудочная железа. Его определение имеет значение в случаях, когда  имеются сомнения, нуждается ли данный пациент в инсулинотерапии. Определение С-пептида не входит в стандартные протоколы обследования.

Если С-пептид снижен, то без инсулина не обойтись. Но при 1 типе диабета, как правило, нет смысла определять С-пептид, т.к. клинические проявления обычно не оставляют сомнений о необходимости инсулинотерапии.

Из других анализов можно остановиться на антидиабетических антителах. Они выявляются у пациентов с диабетом 1 типа за несколько лет до дебюта заболевания, но обычно исчезают в течение нескольких лет после того, как человек заболел. У большей части пациентов их определение не имеет практического смысла. 

Сродство к кислороду – обзор

Взаимодействия: сродство / высвобождение

Сродство гемоглобина к кислороду – это непрерывная взаимосвязь между насыщением гемоглобина кислородом и напряжением кислорода. Обычно ее строят как сигмоидальную кривую кислородного равновесия, и ее можно вкратце выразить как P ₅₀ – то есть напряжение кислорода, при котором 50% гемоглобина насыщается кислородом при стандартной температуре и pH (рис. 71-2). . Сигмоидальная форма кривой равновесия кислород-гемоглобин связана с тем фактом, что гемовые группы реагируют с кислородом в фиксированной последовательности, а оксигенация и деоксигенация одной гемовой группы глубоко влияют на оксигенацию и деоксигенацию других гемовых групп.Это последнее явление получило название взаимодействия гем-гем . По мере того, как каждая гемовая группа принимает кислород, следующей гемовой группе молекулы становится все легче поглощать кислород. Эта концепция подразумевается в уравнении Хилла для процентного насыщения:

, где y – процентное насыщение кислородом, k – константа равновесия, Po ₂ – парциальное давление кислорода, а показатель степени n – среднее количество атомов железа на молекулу гемоглобина.Для нормального гемоглобина n составляет приблизительно 2,9.

По мере того, как кровь циркулирует через нормальное легкое, Po ₂ увеличивается примерно с 40 мм рт. Ст. До 110 мм рт. Ст., Давление, достаточное для обеспечения по крайней мере 95% насыщения гемоглобина кислородом. Отношение равновесия кислород-гемоглобин таково, что любое дальнейшее увеличение напряжения кислорода в легких приводит лишь к небольшому увеличению насыщения. У нормального взрослого человека, когда давление кислорода упало примерно до 27 мм рт.ст., при pH 7.40 и температуре 37 ° C 50% гемоглобина насыщено кислородом (т. Е. P ₅₀ для цельной крови составляет 27 мм рт.

Крутые и пологие участки кривой отражают определяющие процессы разгрузки кислорода. По мере того, как кислород диффундирует из капилляра в ткань, сначала происходит быстрое падение Po ₂ (представленное плоской частью кривой) до тех пор, пока не будет достигнута крутая часть, после чего капилляр Po ₂ уменьшается незначительно, даже если большие количества выделяется кислород.Поскольку напряжение кислорода на поверхности митохондрий, точка использования кислорода, всегда составляет приблизительно от 0,5 до 1,0 мм рт. Ст., ⁵ управляющее давление и, следовательно, скорость доставки кислорода определяется исключительно средним значением Po ₂ в капиллярная кровь. Это, в свою очередь, определяется положением кривой диссоциации на оси Po ₂ и ее крутизной, так что при движении эритроцита через капилляр происходит относительно небольшое изменение управляющего давления.По мере снижения парциального давления кислорода может нарушиться оксигенация тканей. Термин критический Po ₂ был введен для обозначения давления кислорода в крови, ниже которого нарушается диффузия и нарушается функция органов. ²⁴ Критическое значение Po ₂ не может быть четко определенным значением, поскольку клеточные потребности, вероятно, будут различаться в зависимости от органов и зависят от метаболической активности. Например, в головном мозге, органе, в котором адекватное снабжение кислородом необходимо для поддержания энергетического метаболизма, критическое значение Po ₂ составляет примерно 20 мм рт.

Когда сродство гемоглобина к кислороду увеличивается (т. Е. С более низким значением P ₅₀ ), кривая смещается влево, и кислород (который более тесно связан с гемоглобином) высвобождается только при более низких парциальных давлениях. Например, в то время как Po ₂ 40 мм рт. Ст. Приводит к насыщению кислородом 75% при 37 ° C и pH 7,40, сдвиг кривой влево приводит к более высокому насыщению при том же Po ₂ . Результирующее изменение разгрузки кислорода в конечном итоге может привести к нарушению диффузии.При уменьшении сродства (т.е. при более высоком P ₅₀ ) кривая смещается вправо. Следовательно, кислород менее плотно связан с гемоглобином и высвобождается при более высоких парциальных давлениях, тем самым увеличивая разгрузку кислорода на уровне ткани. Следовательно, высвобождение кислорода из крови на тканевом уровне зависит от положения кривой кислородного равновесия, которая, в свою очередь, изменяется внутриэритроцитарным pH, Pco ₂ , температурой и другими факторами, включая концентрацию электролита, уровни органических фосфатов, и тип гемоглобина.

Влияние температуры на кривую кислородного равновесия было впервые отмечено Баркрофтом и Кингом ²⁵ в 1909 году. Повышение температуры сдвигает кривую вправо, тем самым облегчая выделение кислорода. Кроме того, изменения температуры изменяют как фактор Бора, так и эффект 2,3-дифосфоглицерата (2,3-DPG) ²⁶ (обсуждается в следующем разделе). Эффект Бора – это сдвиг вправо кривой кислородного равновесия крови взрослого и плода в ответ на повышение PCO ₂ или снижение pH, или и то, и другое.Разгрузка кислорода определяется градиентом Po ₂ между кровью и тканями. Сдвиг кривой диссоциации оксигемоглобина вправо по мере того, как углекислый газ попадает в кровь из тканей, имеет тенденцию повышать напряжение кислорода, увеличивая градиент для любого заданного насыщения оксигемоглобина и облегчая перенос кислорода к тканям. Изменение в log P ₅₀ на единицу изменения pH (т.е. –Δlog P ₅₀ / –ΔpH) известно как коэффициент Бора . Его значение для крови взрослого человека составляет –0,48, а для новорожденного – –0,44. Эффективный рН – это внутриклеточный рН эритроцита, который обычно на 0,2 единицы меньше рН плазмы на физиологических уровнях, хотя градиент рН в эритроците может варьироваться в зависимости от болезненного состояния. Таким образом, резкое изменение pH на 0,1 единицы изменяет P ₅₀ примерно на 3 мм рт. Эффект Бора более выражен, по крайней мере, экспериментально, когда насыщение кислородом уменьшается и уменьшается в крови, обедненной 2,3-DPG. ²⁷

Эффект Бора, вызванный изменением Pco ₂ при постоянной фиксированной кислоте, больше (–0,48), чем эффект, вызванный изменениями метаболических кислот при постоянном Pco ₂ (–0,40). ²⁷ Молекулярная основа эффекта двуокиси углерода двояка: она следует как за изменениями pH, вызванными двуокисью углерода, так и за действием двуокиси углерода как лиганда, обратимо связывающегося с незаряженными аминогруппами в молекуле гемоглобина с образованием карбаматов. ^28,29 Связанные карбаматы образуют солевые мостики, стабилизируя Т (дезокси) конформацию гемоглобина и снижая сродство гемоглобина к кислороду.Кроме того, сродство других сайтов молекулы гемоглобина к иону водорода (H ⁺ ) усиливается за счет перехода от оксигемоглобина к дезоксигемоглобину, что позволяет дезоксигемоглобину поглощать большую часть H ⁺ , образующегося в результате спонтанной диссоциации угольной кислоты. . Изменяя сродство гемоглобина к кислороду, углекислый газ также способствует газообмену дыхательных путей в легких. В легких углекислый газ отводится эритроцитами в альвеолы. Концентрация углекислого газа падает, тем самым сдвигая кривую кислородного равновесия влево; увеличение сродства гемоглобина к кислороду увеличивает поглощение кислорода альвеолами. ³⁰ Комбинированное воздействие pH, Pco ₂ и температуры на кривую кислородного равновесия теоретически можно рассматривать как благоприятное для выживания видов. Увеличение тканевого метаболизма вызывает повышение локальной температуры, концентрации H ⁺ и Pco ₂ , все из которых повышают P ₅₀ . Результатом является более высокий градиент напряжения кислорода между капилляром и митохондрией в том месте (ткани), где потребление кислорода является самым высоким.Например, было показано, что кривая кислородного равновесия in vivo заметно смещается вправо во время интенсивных упражнений в результате комбинированного воздействия Бора и температуры. ³¹

Давно признано, что кислородное сродство гемоглобина А в свободном растворе значительно выше, чем сродство интактного свежего эритроцита. В 1967 году было продемонстрировано, что взаимодействие с рядом органических фосфатов снижает сродство раствора гемоглобина к кислороду, причем 2,3-DPG является наиболее эффективным. ^32,33 Из органических фосфатов, обычно присутствующих в эритроцитах человека, 2,3-DPG присутствует в наибольших концентрациях и, таким образом, является как качественно, так и количественно наиболее важным фосфатом в отношении модуляции сродства гемоглобина к кислороду. Сродство гемоглобина к кислороду, как указано P ₅₀ , является линейным по отношению к концентрации 2,3-DPG в широком диапазоне; изменение 2,3-DPG / мл эритроцитов на 0,43 ммоль приводит к изменению на 1 мм рт. ст. P ₅₀ . ³⁴ Сильно отрицательно заряженный анион 2,3-DPG связывается преимущественно с дезоксигемоглобином в молярном соотношении 1: 1 в физиологических условиях концентрации растворенного вещества и pH. На молекулярной основе 2,3-DPG снижает сродство к кислороду за счет стабилизации четвертичной структуры дезоксигемоглобина за счет сшивания β-цепей. Второй механизм, с помощью которого 2,3-DPG снижает сродство к кислороду, заключается в изменении внутриэритроцитарного pH относительно pH плазмы. Следовательно, снижение pH снижает сродство к кислороду за счет эффекта Бора.

Что такое p50

Большинство практикующих врачей пытаются улучшить оксигенацию тканей с помощью
увеличение сердечного индекса, артериального давления кислорода или гемоглобина
концентрации. Сродство гемоглобина к кислороду необычно.
рассматривались в эти времена.

Это потому, что гемоглобин-кислород
сродство оказывает комплексное влияние на оксигенацию тканей. Фактически,
изменения кривой диссоциации оксигемоглобина могут иметь
одновременно противодействующие действия за счет поглощения кислорода в легких
по сравнению с кислородной разгрузкой тканей.

Кривая диссоциации оксигемоглобина

Кривая диссоциации оксигемоглобина отображает
взаимосвязь между кислородным напряжением крови и кислородом
насыщенность (рисунок 1). Хотя вся кривая самая лучшая
представление сродства гемоглобина к кислороду, p 50 часто
используется как единственный дескриптор. p 50 – напряжение кислорода
когда гемоглобин насыщен кислородом на 50%. Когда
сродство гемоглобина к кислороду увеличивается, оксигемоглобин
Кривая диссоциации смещается влево и уменьшается p 50.Когда сродство гемоглобина к кислороду уменьшается, оксигемоглобин
кривая диссоциации смещается вправо и увеличивается p 50
(Фигура 1). Сдвиги кривой происходят из-за изменения
четвертичная форма молекулы гемоглобина, которая влияет на кислород
привязка.

РИС. 1. Три кривые диссоциации оксигемоглобина
– нормальный ( p 50 = 26,7 мм рт. ст. (3,5 кПа)), со смещением влево
( p 50 = 17 мм рт. Ст. (2,3 кПа)) и со смещением вправо ( p 50
= 36 мм рт. Ст. (4.8 кПа)). Факторы, вызывающие сдвиг кривой, перечислены на
фигура.

Факторы, увеличивающие p 50, включают падение pH (которое
эффект Бора), высокий уровень эритроцитов
2,3-дифосфоглицерат (2,3-ДПГ) и лихорадка. И наоборот, повышенный pH,
низкий уровень 2,3-ДПГ и снижение гипотермии p 50 (рис.
1).

Важность p 50 изменений

Кривая диссоциации оксигемоглобина имеет сигмовидную форму. Когда
кривой сдвиг, эффект наиболее заметен в середине вокруг
п. 50.Сдвиг намного меньше при низком и высоком содержании кислорода.
напряжения (Рисунок 1).

В результате извлечение такого же количества
кислород из артериальной крови с низким, нормальным и высоким ч 50
значения на уровне моря оставят самое высокое напряжение венозного кислорода
(и, следовательно, кислородное напряжение тканей) в крови с высоким
p 50 (рисунок 2). Однако если такое же извлечение происходит на
вершина горы. Эверест, лучший результат достигается при низком
p 50 кровь (рисунок 2).

РИС.2. Две кривые диссоциации оксигемоглобина,
как на рисунке 1. Две вертикальные линии представляют артериальную
p O ₂ значений на уровне моря (100 мм рт. Ст. (13,3 кПа))
и на вершине горы. Эверест (28 мм рт. Ст. (3,7 кПа)). Круги представляют
венозное напряжение кислорода после экстракции 5 мл кислорода / 100 мл
кровь. (Венозный эффект Бора не учитывается.) Примечание.
что, хотя высокое значение p 50 выгодно на уровне моря,
низкая p 50 предпочтительна на большой высоте.

Эффект Бора проявляется каждый раз, когда артериальная кровь
проходит по капиллярам.Пока кислород разгружается,
p CO ₂ повышается, pH падает, а кривая смещается к
право. В результате увеличения на p 50 сохраняется лучший
давление, приводящее к диффузии кислорода, увеличивает доступность кислорода
у среднего человека примерно на 25 мл / мин. В рабочей мышце, где
есть тепло и высокое производство CO ₂ , это увеличение
доступность кислорода особенно высока.

Стандартное сравнение с in vivo

p 50

Норма p 50 – давление кислорода при
гемоглобин насыщен на 50% при pH = 7.4,
p CO ₂ = 40 мм рт. Ст. (5,3 кПа), температура = 37
° C с карбоксигемоглобином p50 – это давление кислорода, при котором гемоглобин составляет 50%
насыщенный при pH, p CO ₂ , температуре и
концентрация карбоксигемоглобина в крови у субъекта. В
стандарт p 50, таким образом, зависит в первую очередь от 2,3-DPG красных клеток
концентрации и структура гемоглобина. В естественных условиях p 50
отражает суммарный эффект 2,3-ДПГ, структуру гемоглобина,
кислотно-щелочной баланс, температура и дисгемоглобины.Из
Перспектива кислородной нагрузки и разгрузки, in vivo p 50
вот что важно. Если не указано иное, срок р 50
в данной статье означает in vivo p 50.

Расчет

p 50

Для высокоточных p 50 определений
необходимо для построения полной кривой диссоциации оксигемоглобина в
лаборатория. Однако для клинических целей p 50 значений
гораздо проще рассчитать из одноточечного измерения
газов крови и сатурации гемоглобина-кислорода.В
Алгоритм кислородного статуса Сиггаарда-Андерсена является наиболее полезным
одноточечный метод [1]. Это потому, что он остается точным до
насыщение гемоглобина кислородом 97% обеспечило оксигемоглобин
кривая диссоциации сохраняет свою форму.

Нормальный

р 50

p 50 животных каждого вида эволюционировали
на протяжении тысячелетий из-за давления экологического отбора, и
предположительно оптимален для потребления кислорода тканями, орган
плотность капилляров и давление кислорода в окружающей среде животного.Значение для человека составляет 26,7 кПа (3,5 кПа). В общем, меньше
животные имеют более высокие значения p 50 (рисунок 3).

РИС. 3. Сравнение значений p 50,
потребление кислорода тканями (VO ₂ ) и тканевыми капиллярами
плотность у лошади и мыши. Отметим, что четырехкратное увеличение
плотность капилляров у мыши недостаточна, чтобы компенсировать
шестнадцатикратное увеличение VO ₂ . Увеличение
ч 50 – необходимая адаптация.

p 50 в критическом состоянии

При критическом заболевании многие факторы, влияющие на
p 50 могут работать время от времени одновременно. Ацидемия
увеличивает p 50 за счет эффекта Бора, но в то же время
снижает выработку 2,3-ДПГ, уменьшая p 50. Алкалиемия делает
противоположный. Гипофосфатемия снижает выработку 2,3-ДПГ и
гиперфосфатемия увеличивает его. Увеличивается длительная гипоксемия
Концентрации 2,3-ДПГ и, следовательно, p 50.Повышается температура
п. 50.

Окончательный результат предсказать сложно. Недавно группа
Было показано, что у австралийских пациентов в критическом состоянии нормальное среднее
in vivo p 50 [2], несмотря на пониженное среднее значение 2,3-DPG
концентрации (и, следовательно, стандарт p 50). Это 2,3-ДПГ
снижение было связано почти исключительно с ацидемией. Два других исследования
тяжелобольные пациенты также выявили пониженный стандарт
p 50, что подразумевает низкие концентрации 2,3-DPG [3,4]. Тот самый
Исключение составляет Бельгия, где пациенты с острым респираторным
синдром дистресса и выраженная гипоксемия повышены
Концентрации 2,3-ДПГ [5].

Желаемый

p 50 ответ на гипоксию

Исследуемые препараты и заменители гемоглобина
которые могут надежно изменить p 50 уже существуют. Как
результат, большое внимание уделяется наилучшему способу манипулирования
p 50 (если вообще), когда доставка кислорода тканям ниже
угроза. Проще говоря, p 50, который лучше всего сохраняет
смешанное венозное напряжение кислорода является подходящей защитой
оксигенация митохондрий.

Низкое давление кислорода в окружающей среде (нормальный градиент A-a)

Математическое моделирование предсказывает, что
p 50 защитит митохондрии от неблагоприятных воздействий окружающей среды.
гипоксия, и данные животных и человека подтверждают эту идею [6]. Для
Например, животные, адаптированные к гипоксической среде, такой как глубокая
в норках или на большой высоте p 50 ниже, чем у аналогичных
виды, дышащие нормальным атмосферным кислородом. Аналогично плодный
кровь (HbF; p 50 = 19.4 мм рт. Ст. (2,6 кПа)) имеет низкий
p 50 как приспособление к гипоксическим условиям в
матка.

Критическая болезнь

Напротив, при недостаточной доставке кислорода тканям
возникает при критическом заболевании, практически никогда не бывает из-за окружающей среды.
гипоксия. За исключением тяжелой гиповентиляции, артериальная
гипоксемия обычно связана с повышенным градиентом A-a,
обычно от легочной патологии или (редко) от внутрисердечной
маневровые. У тяжелобольных пациентов также снижается уровень кислорода в тканях.
родоразрешение от различных комбинаций состояний низкой выработки и анемии.

Сильная сосудистая непроходимость может вызвать тяжелую региональную ишемию. В
все эти сценарии, увеличение p 50 должно улучшить
венозное напряжение кислорода для данной экстракции кислорода. Однако, как
подача кислорода продолжает падать, а фракция экстракции
увеличивается, преимущество, получаемое за счет увеличения p 50, будет
постепенно уменьшаются. При крайней гипоперфузии практически
исчезает.

Клинические и экспериментальные данные в значительной степени подтверждают эти концепции.
и хорошо иллюстрируются выводами, касающимися
следственный агент RSR13.RSR13 увеличивает p 50 на
изменение формы гемоглобина и, как было показано, увеличивает ткани
p O2. Преимущества были замечены в экспериментальной опухоли
облучение [7], инсульты [8] и ишемия миокарда [9].

Однако
в сценариях с очень высокой экстракцией он теряет эффективность [10], и он
может даже повредить такие органы, как почки, где артериовенозная
шунтирование уже вызывает очень низкое кислородное напряжение тканей
[11,12].

Заключение

Возможно, скоро удастся достичь значительных
p 50 возвышений с использованием растворов искусственного гемоглобина или
препараты, влияющие на форму молекул гемоглобина.Однако, несмотря на
обнадеживающие теоретические и экспериментальные данные, остается
Установлено, что манипуляции р 50 при критическом состоянии
может улучшить газообмен, оксигенацию тканей или исход. Когда мы
есть более убедительные доказательства того, что это правда, статус р 50
потребует рутинной количественной оценки и рассмотрения.

39.4A: Транспорт кислорода в крови

Большая часть кислорода в организме переносится гемоглобином, который находится внутри красных кровяных телец.

Задачи обучения

• Описать, как кислород связывается с гемоглобином и транспортируется в ткани тела

Ключевые точки

• Гемоглобин состоит из четырех субъединиц и может связывать до четырех молекул кислорода.
• Уровни углекислого газа, pH крови, температура тела, факторы окружающей среды и болезни – все это может влиять на пропускную способность и доставку кислорода.
• Снижение способности гемоглобина переносить кислород наблюдается при повышении содержания углекислого газа и температуры, а также снижении pH в организме.
• Серповидно-клеточная анемия и талассемия – два наследственных заболевания, снижающих способность крови переносить кислород.

Ключевые термины

• талассемия : наследственное заболевание, при котором человек производит большое количество эритроцитов, но клетки имеют более низкий уровень гемоглобина
• серповидно-клеточная анемия : наследственное заболевание крови, характеризующееся эритроцитами, которые принимают аномальную, жесткую, серповидную форму
• гем : компонент гемоглобина, отвечающий за связывание кислорода; состоит из иона железа, связывающего кислород, и порфиринового кольца, связывающего молекулы глобина; одна молекула связывает одну молекулу кислорода

Транспорт кислорода в крови

Хотя кислород растворяется в крови, таким образом транспортируется лишь небольшое количество кислорода.Только 1,5 процента кислорода в крови растворяется непосредственно в самой крови. Большая часть кислорода, 98,5 процента, связана с белком, называемым гемоглобином, и переносится в ткани.

Гемоглобин

Гемоглобин, или Hb, представляет собой молекулу белка, обнаруженную в красных кровяных тельцах (эритроцитах), состоящую из четырех субъединиц: двух альфа-субъединиц и двух бета-субъединиц. Каждая субъединица окружает центральную группу гема, которая содержит железо и связывает одну молекулу кислорода, позволяя каждой молекуле гемоглобина связывать четыре молекулы кислорода.Молекулы с большим количеством кислорода, связанного с гемовыми группами, имеют ярко-красный цвет. В результате насыщенная кислородом артериальная кровь, в которой гемоглобин переносит четыре молекулы кислорода, становится ярко-красной, а деоксигенированная венозная кровь – более темно-красной.

Рисунок \ (\ PageIndex {1} \): Гемоглобин : Белок внутри красных кровяных телец (а), который переносит кислород к клеткам и углекислый газ в легкие, – это гемоглобин (b). Гемоглобин состоит из четырех симметричных субъединиц и четырех гемовых групп. Железо, связанное с гемом, связывает кислород.Это железо в гемоглобине, которое придает крови красный цвет.

Вторую и третью молекулу кислорода связать с Hb легче, чем первую молекулу. Это связано с тем, что молекула гемоглобина меняет свою форму или конформацию при связывании кислорода. В таком случае четвертый кислород связать труднее. Связывание кислорода с гемоглобином можно изобразить как функцию парциального давления кислорода в крови (ось x) в зависимости от относительного насыщения Hb-кислородом (ось y). Полученный график, кривая диссоциации кислорода, имеет сигмоидальную или S-образную форму.По мере увеличения парциального давления кислорода гемоглобин становится все более насыщенным кислородом.

Рисунок \ (\ PageIndex {1} \): Кривая диссоциации кислорода : Кривая диссоциации кислорода демонстрирует, что по мере увеличения парциального давления кислорода большее количество кислорода связывает гемоглобин. Однако сродство гемоглобина к кислороду может сдвигаться влево или вправо в зависимости от условий окружающей среды.

Факторы, влияющие на связывание кислорода

Переносная способность гемоглобина по кислороду определяет, сколько кислорода переносится кровью.Кроме того, другие факторы окружающей среды и заболевания также могут влиять на способность переносить кислород и доставку; то же самое верно для уровня углекислого газа, pH крови и температуры тела. Когда диоксид углерода находится в крови, он реагирует с водой с образованием бикарбоната (HCO ₃ ^– ) и ионов водорода (H ⁺ ). По мере увеличения уровня углекислого газа в крови вырабатывается больше H ⁺ и снижается pH. Увеличение углекислого газа и последующее снижение pH снижает сродство гемоглобина к кислороду.Кислород диссоциирует от молекулы Hb, сдвигая кривую диссоциации кислорода вправо. Следовательно, для достижения такого же уровня насыщения гемоглобина, как при более высоком pH, требуется больше кислорода. Подобный сдвиг кривой также является следствием повышения температуры тела. Повышенная температура, например, из-за повышенной активности скелетных мышц, вызывает снижение сродства гемоглобина к кислороду.

Заболевания, такие как серповидно-клеточная анемия и талассемия, снижают способность крови доставлять кислород к тканям и ее способность переносить кислород.При серповидно-клеточной анемии форма красных кровяных телец имеет серповидную форму, удлиненная и жесткая, что снижает их способность доставлять кислород. В этой форме эритроциты не могут проходить через капилляры. Когда это происходит, это болезненно. Талассемия – редкое генетическое заболевание, вызванное дефектом альфа- или бета-субъединицы гемоглобина. Пациенты с талассемией производят большое количество красных кровяных телец, но в этих клетках уровень гемоглобина ниже нормы. Следовательно, пропускная способность кислорода снижается.

Рисунок \ (\ PageIndex {1} \): Серповидно-клеточная анемия : У людей с серповидно-клеточной анемией эритроциты имеют форму полумесяца. Заболевания, подобные этому, вызывают снижение способности доставки кислорода по всему телу.

Высокий гемоглобин связан с увеличением госпитальной смертности у пациентов с хронической обструктивной болезнью легких и хронической болезнью почек: ретроспективное многоцентровое популяционное исследование | BMC Pulmonary Medicine

3.

Vasquez A, Logomarsino СП. Анемия при хронической обструктивной болезни легких и потенциальная роль дефицита железа. ХОБЛ. 2016; 13: 100–9.

Артикул

Google Scholar

10.

Каваками Й., Киши Ф., Ямамото Х., Миямото К. Связь доставки кислорода, смешанной венозной оксигенации и легочной гемодинамики с прогнозом при хронической обструктивной болезни легких.N Engl J Med. 1983; 308: 1045–9.

CAS
Статья

Google Scholar

Развивающееся увеличение сродства гемоглобина к кислороду и эффект Бора совпали с водной специализацией пингвинов

Abstract

Возможности ныряния у дышащих воздухом позвоночных диктуются бортовыми хранилищами O ₂ , что свидетельствует о физиологической специализации ныряющих птиц, например пингвины могли участвовать в адаптивных изменениях конвективного переноса O ₂ .Была выдвинута гипотеза, что повышенное сродство к гемоглобину (Hb) -O ₂ улучшает извлечение O ₂ из легких и увеличивает возможности для ныряния с задержкой дыхания. Чтобы исследовать эволюцию изменений функции гемоглобина, связанных с водной специализацией пингвинов, мы объединили сравнительные измерения цельной крови и очищенного природного гемоглобина с экспериментами по инженерии белков, основанными на сайт-направленном мутагенезе. Мы реконструировали и воскресили предков Hbs, представляющих общего предка пингвинов и более древнего предка, общего для пингвинов и их ближайших неживых родственников (отряд Procellariiformes, который включает альбатросов, буревестников, буревестников и буревестников). Эти два предка ограничивают филогенетический интервал, в котором могли бы развиться специфические для пингвинов изменения функции гемоглобина. Эксперименты показали, что пингвины развили производное увеличение сродства Hb-O ₂ и значительно усилили эффект Бора (снижение сродства Hb-O ₂ при низком pH). Хотя повышенное сродство Hb-O ₂ снижает градиент диффузии O ₂ из системных капилляров в метаболизирующие клетки, это может быть компенсировано сопутствующим усилением эффекта Бора, тем самым способствуя разгрузке O ₂ в подкисленных тканях.Мы предполагаем, что эволюционировавшее увеличение сродства Hb-O ₂ в сочетании с усиленным эффектом Бора максимизирует как извлечение O ₂ из легких, так и выгрузку O ₂ из крови, что позволяет пингвинам полностью использовать свой бортовой O _{. 2} хранит и максимально увеличивает время кормления под водой.

Заявление о конкурирующем интересе

Авторы заявили об отсутствии конкурирующего интереса.

Развитое увеличение сродства гемоглобина и кислорода, и эффект Бора совпал с водной специализацией пингвинов

Значимость

У ныряющих птиц, таких как пингвины, физиологические соображения предполагают, что повышенное сродство гемоглобина (Hb) -O ₂ может улучшить легочный O ₂ экстракция и увеличение погружения.Мы объединили экспериментальные тесты цельной крови и нативного Hbs пингвинов с экспериментами по инженерии белка на реконструированных предковых Hbs. Эксперименты, связанные с воскрешением предковых белков, позволили нам проверить эволюционные изменения функции Hb в стволовой линии пингвинов после расхождения с их ближайшими неживыми родственниками. Мы демонстрируем, что пингвины развили повышенное сродство Hb-O ₂ в сочетании со значительно усиленным эффектом Бора (т. Е. Снижение сродства Hb-O ₂ при низком pH), что должно максимизировать легочную экстракцию O ₂ без ущерба для O ₂ доставка в системные капилляры.

Abstract

Возможности нырять у дышащих воздухом позвоночных диктуются бортовыми магазинами O ₂ , предполагая, что физиологическая специализация ныряющих птиц, таких как пингвины, могла включать адаптивные изменения в конвективном переносе O ₂ . Была выдвинута гипотеза, что повышенное сродство к гемоглобину (Hb) -O ₂ улучшает легочную экстракцию O ₂ и увеличивает способность нырять с задержкой дыхания. Чтобы изучить эволюционные изменения функции гемоглобина, связанные с водной специализацией пингвинов, мы объединили сравнительные измерения цельной крови и очищенного нативного гемоглобина с экспериментами по белковой инженерии, основанными на сайт-направленном мутагенезе.Мы реконструировали и воскресили предкового Hb, представляющего общего предка пингвинов и более древнего предка, общего для пингвинов и их ближайших неживых родственников (отряд Procellariiformes, который включает альбатросов, буревестников, буревестников и буревестников). Эти два предка ограничивают филогенетический интервал, в котором могли бы развиться специфические для пингвинов изменения функции гемоглобина. Эксперименты показали, что пингвины развили производное увеличение сродства Hb-O ₂ и значительно усилили эффект Бора (т.е., пониженное сродство Hb-O ₂ при низком pH). Хотя повышенное сродство Hb-O ₂ снижает градиент диффузии O ₂ из системных капилляров в метаболизирующие клетки, это может быть компенсировано сопутствующим усилением эффекта Бора, тем самым способствуя разгрузке O ₂ в подкисленных тканях. Мы предполагаем, что эволюционировавшее увеличение сродства Hb-O ₂ в сочетании с усиленным эффектом Бора максимизирует как извлечение O ₂ из легких, так и выгрузку O ₂ из крови, что позволяет пингвинам полностью использовать свой бортовой O _{. 2} хранит и максимально увеличивает время кормления под водой.

У дышащих воздухом позвоночных возможности нырять определяются бортовыми запасами O ₂ и эффективностью использования O ₂ в метаболизме тканей (1). У полностью водных таксонов отбор на продление погружения с задержкой дыхания и время подводного кормления, возможно, способствовал адаптивным изменениям во многих компонентах пути транспорта O ₂ , включая свойства оксигенации гемоглобина (Hb). Hb позвоночных – это тетрамерный белок, который отвечает за циркуляторный транспорт O ₂ , загрузку O ₂ в легочные капилляры и выгрузку O ₂ в системный кровоток через четвертичные структурные сдвиги между высокоаффинными (преимущественно оксигенированными) расслабленными ( R) состояние и низкоаффинное (преимущественно деоксигенированное) напряженное (T) состояние (2).Хотя этот механизм респираторного транспорта газов сохраняется у всех Hbs позвоночных, вариации аминокислот в составляющих субъединицах α- и β-типа могут изменять внутреннее сродство O ₂ и реакцию на изменения температуры, pH эритроцитов и эритроцитов. концентрации аллостерических кофакторов (негемовых лигандов, которые модулируют аффинность Hb-O ₂ , предпочтительно связывая и стабилизируя дезокси-Т-конформацию) (3, 4).

Хотя количество Hb обычно повышено в крови ныряющих птиц и млекопитающих по сравнению с их наземными родственниками, нет единого мнения о том, способствовали ли эволюционные изменения сродства Hb-O ₂ повышению способности нырять (1).Была выдвинута гипотеза, что повышенное сродство Hb-O ₂ может улучшить извлечение легочного O ₂ у ныряющих млекопитающих, тем самым повышая способность нырять (5), но для оценки доказательств адаптивной тенденции необходимы дополнительные сравнительные данные (6, 7 ). Экспериментальные измерения цельной крови предполагают, что императорский пингвин ( Aptenodytes forsteri ) может иметь более высокое сродство к крови-O ₂ по сравнению с неживыми водоплавающими птицами, открытие, которое укрепило мнение о том, что это свойство характеризует пингвинов как группу ( 8⇓ – 10).Однако сродство к крови-O ₂ является очень пластичным признаком, на который влияют изменения в метаболизме эритроцитов и кислотно-щелочном балансе, поэтому измерения очищенного гемоглобина в стандартных условиях анализа необходимы для оценки наблюдаемых межвидовых различий в крови-O. ₂ сродство связано с генетически обусловленными изменениями свойств оксигенации Hb. Более того, даже если видовые различия в аффинности Hb-O ₂ имеют генетическую основу, сравнительные данные по существующим таксонам не показывают, связаны ли наблюдаемые различия с производным увеличением численности пингвинов, производным сокращением их недивущих родственников или комбинацией этих факторов. меняется в обоих направлениях.

Для исследования эволюционирующих изменений функции гемоглобина, связанных с водной специализацией пингвинов, мы объединили экспериментальные измерения цельной крови и очищенного природного гемоглобина с эволюционным анализом вариации последовательности глобина. Чтобы охарактеризовать механистическую основу эволюционных изменений функции гемоглобина в стволовой линии пингвинов, мы провели эксперименты по белковой инженерии на реконструированном и воскрешенном предковом гемоглобине, представляющем общего предка пингвинов и более древнего предка, общего для пингвинов и их ближайших неживых родственников (порядок Procellariiformes, в который входят альбатросы, буревестники, буревестники и буревестники) (рис.1). Эти два предка ограничивают филогенетический интервал, в котором могли бы развиться специфические для пингвинов изменения функции гемоглобина.

Рис. 1.

Диаграмма филогении, показывающая родство между Sphenisciformes (пингвины), Procellariiformes и Pelecaniformes. Hbs предков были реконструированы для двух указанных узлов: AncSphen и AncPro (суперотряд, содержащий Sphenisciformes и Procellariiformes). Время расхождения адаптировано из Claramunt и Cracraft (56).

Результаты и обсуждение

O

₂ -Связывающие свойства цельной крови пингвинов и очищенного гемоглобина.

Используя образцы крови нескольких особей шести видов пингвинов, мы измерили парциальное давление O ₂ (PO ₂ ) при 50% насыщении (P ₅₀ ) для цельной крови и очищенного Hb в отсутствие ( обнаженный) и присутствие аллостерических кофакторов (+ KCl + IHP [инозитол гексафосфат]) (рис. 2). Цельнокровные значения P ₅₀ были одинаковыми для всех пингвинов, в среднем 33,3 ± 1,1 торр (рис.2 и SI Приложение , таблица S1), что согласуется с ранее опубликованными данными для пингвинов императора, Адели, антарктического ремня и папуасского пингвина (8 , 9, 11).Аналогичным образом, измеренное сродство O ₂ к очищенному Hb показало очень небольшие различия между видами как в присутствии, так и в отсутствие аллостерических кофакторов (рис. 2 и SI, приложение , таблица S1). Пингвины экспрессируют одну изоформу Hb в постнатальном периоде жизни (HbA), в отличие от большинства других видов птиц, которые экспрессируют одну главную и одну второстепенную изоформу (HbA и HbD соответственно) (12, 13). Отсутствие вариации сродства Hb-O ₂ у пингвинов согласуется с низким уровнем вариабельности аминокислот в α- и β-цепях ( SI Приложение , рис.S1). Эксперименты показали, что гемоглобин пингвинов демонстрирует удивительно большой сдвиг в величине эффекта Бора (т. Е. Снижение сродства Hb-O ₂ в ответ на снижение pH) при добавлении аллостерических кофакторов ( SI Приложение , таблица S1) . Средний эффект Бора пингвинов Hbs более чем удваивается при добавлении аллостерических кофакторов, от -0,21 ± 0,03 до -0,53 ± 0,04 ( SI Приложение , Таблица S1).

Рис. 2.

P _{50 Значения} для цельной крови пингвинов и очищенного гемоглобина при 37 ° C, в отсутствие (выделено) и в присутствии 100 мМ KCl и 0.2 мМ IHP (+ KCl + IHP). Чем выше P ₅₀ , тем ниже сродство Hb-O ₂ . Значения P ₅₀ цельной крови представлены как среднее ± стандартная ошибка ( n = 3). Значения очищенного Hb P ₅₀ получены из графиков зависимости logP ₅₀ от pH, на которых линейная регрессия соответствовала оценке P ₅₀ при точно pH 7,40 (± SE оценки регрессии).

Наши экспериментальные результаты показывают, что пингвины обычно имеют более высокое сродство Hb-O ₂ , чем другие птицы (12, 14⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓ – 22), что согласуется с предыдущими предположениями, основанными на измерениях цельной крови (8, 9, 23⇓ – 25).Цельная кровь O ₂ сродство шести исследованных видов пингвинов (от 30,4 до 38,1 торр при 37 ° C, pH 7,40) было неизменно выше, чем у представителя семейства Procellariiformes, южного гигантского буревестника ( Macronectes giganteus ; 42,5 торр при 38 ° C, pH 7,40) (9). Точно так же многие виды высокогорных птиц конвергентно эволюционировали с повышенным сродством Hb-O ₂ (17, 18, 21), которое, по-видимому, является адаптивным, поскольку помогает защитить артериальное насыщение O ₂ , несмотря на снижение PO ₂ в крови. вдыхаемый воздух (26⇓ – 28).Разница в значениях P ₅₀ в крови между пингвинами и южным гигантским буревестником, как правило, намного больше по величине, чем различия в Hb P ₅₀ между близкородственными видами низко- и высокогорных птиц (14⇓⇓⇓ – 18, 20⇓ – 22). Как и в случае с другими ныряющими позвоночными (29), эффект Бора Hb пингвина также значительно превышает типичные для птиц значения.

Воскрешение белков предков.

В принципе, наблюдаемое различие сродства Hb-O ₂ между пингвинами и их ближайшими неживыми родственниками можно объяснить производным увеличением сродства Hb-O ₂ в линии пингвинов (обычно предполагаемый адаптивный сценарий), производное сокращение стволовой линии Procellariiformes (неживой сестринской группы) или комбинация изменений в обоих направлениях.Чтобы проверить эти альтернативные гипотезы, мы реконструировали Hbs общего предка пингвинов (AncSphen) и более древнего общего предка Procellariimorphae (надотряд, состоящий из Sphenisciformes [пингвинов] и Procellariiformes; AncPro) (рис. 1 и SI Приложение , Рис. S2 – S4). Затем мы рекомбинантно экспрессировали и очищали предковый гемоглобин для проведения функциональных тестов in vitro. Измерения равновесных кривых O ₂ показали, что AncSphen Hb имеет значительно более высокое сродство к O ₂ , чем AncPro Hb (рис.3), что указывает на то, что пингвины развили производное увеличение сродства Hb-O ₂ . В присутствии аллостерических кофакторов P ₅₀ AncSphen намного ниже (т. Е. Сродство к O ₂ выше) по сравнению с AncPro (11,8 против 20,2 торр). Подобно эволюционировавшему увеличению сродства Hb-O ₂ у высокогорных птиц (18, 20⇓ – 22, 30), повышенное сродство Hb-O ₂ пингвинов Hb скорее связано с увеличением внутреннего сродства, чем с сниженная чувствительность к аллостерическим кофакторам, поскольку разница в аффинности Hb-O ₂ между AncSphen и AncPro сохраняется в присутствии и отсутствии Cl ^– и IHP (рис.3).

Рис. 3.

Структурные ( A – C ) и физиологические ( D и E ) эффекты аминокислотных замен в реконструированных белках Hb предка пингвинов (AncSphen) и последних общих предков пингвинов. совместно с Procellariiformes (AncPro). ( A ) Молекулярная модель тетрамера AncSphen Hb с черным прямоугольником, показывающим области, выделенные в B и C . ( B ) Молекулярная модель AncSphen Hb, демонстрирующая межсубъединичные стабилизирующие Н-связи (розовый) между β119Ser и как α111Ile, так и β120Lys.( C ) Молекулярная модель AncPro Hb, показывающая, что замена β119Ser на Thr удаляет межсубъединичные стабилизирующие Н-связи. ( D ) Hb-O ₂ сродство (измеряемое с помощью P ₅₀ ) AncSphen, AncPro и двух мутантных rHbs со специфическими для пингвинов аминокислотными заменами, введенными на фоне AncPro: AncProβ119Ser и AncPro + 4. См. В тексте объяснение выбора сайтов-кандидатов для экспериментов по мутагенезу. Измерения проводились на растворах Hb (0.1 мМ Hb в 0,1 М Hepes / 0,5 мМ EDTA) при 37 ° C в отсутствие (снятый) и в присутствии + KCl + IHP. Значения P ₅₀ получены из графиков зависимости logP ₅₀ от pH, на которых линейная регрессия соответствовала оценке P ₅₀ при точно pH 7,40 (± SE оценки регрессии). ( E ) Коэффициенты Бора (Δlog P ₅₀ / ΔpH) были оценены из графиков зависимости logP ₅₀ от pH, на которых эффект Бора представлен наклоном линейной регрессии (± SE оценки наклона) .

В дополнение к производному увеличению сродства Hb-O ₂ , сравнения AncSphen и AncPro также показали, что Hb пингвинов развил повышенную чувствительность к pH (эффект Бора). В условиях снятия изоляции эффекты Бора AncSphen и AncPro (-0,30 ± 0,09 и -0,27 ± 0,1, соответственно) были очень похожи друг на друга и аналогичны значениям, измеренным для нативного гемоглобина пингвинов в тех же условиях (рис. 3 E ). и SI Приложение , Таблица S1).Однако в присутствии аллостерических кофакторов эффект Бора AncSphen увеличился более чем в два раза (аналогично эффекту нативного Hb пингвинов), тогда как эффект AncPro показал незначительные изменения (рис. 3 E ), демонстрируя, что пингвины эволюционировали. усиление эффекта Бора, связанного с кофактором, после расхождения с их неживыми родственниками. Ожидается, что повышенное сродство Hb-O ₂ уменьшит градиент диффузии O ₂ из системных капилляров в клетки метаболизирующих тканей, а усиленный эффект Бора может компенсировать это за счет снижения сродства Hb-O ₂ при низкий pH, что способствует разгрузке O ₂ в подкисленных тканях.Подобное усиление эффекта Бора недавно было зарегистрировано в Hb высокогорных тибетских псовых (31). Таким образом, гемоглобин пингвинов развил увеличение сродства к O ₂ и усиленный эффект Бора в сочетании с другими физиологическими и морфологическими специализациями для более полного водного существования.

Тесты положительного отбора.

Учитывая, что совместное увеличение аффинности O ₂ и эффект Бора гемоглобина пингвинов представляют собой производные состояния характера, мы провели анализ молекулярной эволюции, чтобы проверить доказательства положительного отбора в генах α- и β-глобина.В частности, мы проверили ускоренную скорость замены аминокислот в стволовой линии пингвинов (ветвь, соединяющая AncPro с AncSphen) с помощью теста сайтов ветвлений. Этот тест не выявил доказательств ускоренной скорости замены аминокислот в стволовой линии пингвинов ( SI, приложение , таблица S2), а тест клады не выявил значительных различий в скорости замены между различными линиями пингвинов ( SI, приложение ). , Таблица S3). Таким образом, если повышенное сродство пингвинов к Hb-O ₂ представляет собой адаптацию, которая возникла в результате положительного отбора, природа причинных изменений не привела к обнаруживаемой статистической сигнатуре в генах глобина α- и β-типа.

Молекулярное моделирование.

Мы использовали молекулярное моделирование, чтобы определить, какие конкретные аминокислотные замены могут быть ответственны за повышенное сродство Hb-O ₂ AncSphen по сравнению с AncPro. Из 17 аминокислотных замен, которые различают AncSphen и AncPro, наш анализ выявил четыре замены, которые потенциально могут изменять свойства связывания O ₂ . Замена Thrβ119Ser в ветви, ведущей к AncSphen, влияет на стабилизацию R-состояния (оксигенированного) Hb.В частности, гидроксильная группа β119Ser в спирали G ориентирована по направлению к границе раздела субъединиц, образуя водородную связь с β120Lys, которая обеспечивает межсубъединичный контакт с α111Ile (рис. 3 A и B ). Эта связь между β119Ser и α111Ile стабилизирует конформацию состояния R за счет ограничения межсубъединичных движений, что, как прогнозируется, увеличивает сродство Hb-O ₂ за счет увеличения свободной энергии связанного с оксигенацией аллостерического перехода R → T в четвертичной структуре.Кроме того, наша модель идентифицировала три другие аминокислотные замены – αA138S, βA51S и βI55L – которые создают межсубъединичные контакты и дополнительно стабилизируют конформацию R-состояния.

Тестирование причинных замен.

Чтобы проверить основанные на модели прогнозы о конкретных заменах, которые ответственны за повышенную аффинность O ₂ пингвинового Hb, мы использовали сайт-направленный мутагенез для введения комбинаций мутаций в четырех сайтах-кандидатах на фоне AncPro.Сначала мы проверили эффект одной мутации, в результате которой β119Thr был заменен на Ser (AncProβT119S). Затем мы проверили чистый эффект мутаций на всех четырех сайтах на фоне AncPro (AncPro + 4: αA138S, βA51S, βI55L и βT119S). Эксперименты по белковой инженерии показали, что βT119S оказывает незначительное индивидуальное влияние на сродство Hb-O ₂ при введении на фоне AncPro, но вызывает заметное усиление эффекта Бора (рис. 3 D и E ).Комбинация четырех мутаций приводила к умеренному увеличению сродства Hb-O ₂ и более выраженному усилению эффекта Бора, но они не полностью воспроизводили наблюдаемые различия между AncPro и AncSphen в любом из этих свойств (рис. 3). . Эти данные предполагают, что эволюционирующие функциональные изменения гемоглобина пингвинов должны быть связаны с чистым эффектом множественных аминокислотных замен в структурно различных сайтах.

Адаптивная значимость повышенного Hb-O

₂ Сродство.

Ключом к увеличению времени погружения водных позвоночных является увеличение пропускной способности O ₂ при сохранении метаболических требований O ₂ на минимально возможном уровне во время погружения с задержкой дыхания. Погружение вызывает интенсивную брадикардию и периферическую вазоконстрикцию, которая сохраняет конечные запасы O ₂ для тканей, непереносимых к гипоксии (т. Е. Центральной нервной системы и сердца) (32–35). O ₂ запасов обычно увеличивается у ныряющих позвоночных за счет увеличения объема крови, увеличения концентрации гемоглобина в крови, увеличения концентрации миоглобина в скелетных мышцах, увеличения мышечной массы и, иногда, увеличения объема легких у ныряльщиков (1).Поскольку глубоко ныряющие китообразные и ластоногие выдыхают перед погружением, их легкие составляют менее 10% от общего количества O ₂ (1, 36). Это уменьшение объема легких при нырянии уменьшает газообразный N ₂ и O ₂ , что предположительно ограничивает декомпрессионную болезнь. И наоборот, поскольку пингвины вдыхают в начале погружения, объем их ныряющих легких составляет гораздо больший процент от общих запасов O ₂ (19% для императорских пингвинов и 45% для пингвинов Адели) (1, 37).Действительно, у ныряющих императорских пингвинов извлечение O ₂ из легочных запасов происходит непрерывно во время погружения (38, 39). Повышенное сродство Hb-O ₂ (например, обнаруженное у пингвинов) может максимизировать извлечение O ₂ из легочных запасов, поскольку большее насыщение крови O ₂ может быть достигнуто при любом заданном парабронхиальном значении PO ₂ . Однако, хотя повышенное сродство Hb-O ₂ может обеспечить более полный перенос O ₂ из легких в кровь, оно может ингибировать последующий перенос O ₂ из крови в ткани.Несмотря на это, императорские пингвины почти полностью истощают свои кровеносные сосуды во время продолжительных погружений, поскольку их венозный PO ₂ в конце погружения может быть всего лишь от 1 до 6 торр (38). Усиленный эффект Бора гемоглобина пингвина должен улучшить транспорт O ₂ в рабочие (кислые) ткани, позволяя более полно разгрузить кровь O ₂ . Мы предлагаем, чтобы эта модификация работала в тандеме с повышенным сродством Hb-O ₂ , чтобы максимально увеличить как извлечение O ₂ из легких, так и выгрузку O ₂ из крови, что позволяет пингвинам полностью использовать свои встроенные хранилища O ₂ . и максимально увеличить время кормления под водой.

Материалы и методы

Сбор крови.

Мы собрали кровь у 18 отдельных пингвинов, представляющих шесть видов: A. forsteri , Aptenodytes patagonicus , Pygoscelis adeliae , Pygoscelis papua , Pygoscelis antarcticus 0007 и an Magazine 0007 особей на вид). Все птицы были взяты во время плановых проверок здоровья в SeaWorld of California. Кровь собирали путем венепункции яремной вены с использованием набора для забора крови BD Vacutainer Safety-Lok с 21 G × 3/4 дюйма (0.8 × 19 мм), прикрепленную к пробирке для забора крови с гепарином (BD). Подвыборка цельной крови (200 мкл) была отложена для кривых кислородного равновесия (см. Ниже), а оставшаяся кровь центрифугировалась при 5000 × g в течение 15 мин. Плазма, лейкоцитарная пленка и фракции гематокрита от центрифугированных образцов были немедленно помещены в отдельные пробирки и быстро заморожены при -80 ° C для будущих анализов.

Секвенирование генов пингвинов глобина.

Секвенирование гена глобина проводили, как описано ранее (40).Вкратце, РНК экстрагировали из ~ 100 мкл мгновенно замороженных эритроцитов с помощью набора Qiagen RNeasy Universal Plus Mini Kit. кДНК синтезировали из свежеприготовленной РНК с использованием обратной транскриптазы SuperScript IV (Invitrogen). Ген-специфические праймеры, используемые для амплификации транскриптов глобина α- и β-типа, были сконструированы из 5′- и 3′-фланкирующих областей всех общедоступных генов глобина пингвинов. Реакции ПЦР проводили с использованием 1 мл матрицы кДНК в пробирках объемом 0,2 мл, содержащих 25 мкл реакционной смеси (0.5 мкл каждого dNTP [2,5 мМ], 2,5 мкл 10-кратного реакционного буфера [Invitrogen], 0,75 мкл 50 мМ MgCl ₂ , 1,25 мкл каждого праймера [10 пмоль / мкл], 1 мкл полимеразы Taq [Invitrogen] и 16,75 мкл ddH ₂ O), используя градиентный термоциклер Eppendorf Mastercycler. После 5-минутного периода денатурации при 94 ° C желаемые продукты амплифицировали с использованием профиля циклов 94 ° C в течение 30 секунд, от 53 до 65 ° C в течение 30 секунд и 72 ° C в течение 45 секунд в течение 30 циклов с последующим последним 5-минутным периодом продления при 72 ° C.Амплифицированные продукты обрабатывали на 1,5% агарозном геле, после чего полосы нужного размера вырезали и очищали с использованием колонок для восстановления ДНК Zymoclean Gel (Zymo Research). Очищенные в геле продукты ПЦР лигировали в векторы pCR4-TOPO с использованием набора для клонирования TOPO TA, а затем трансформировали в химически компетентный One Shot TOP10 Escherichia coli (Thermo Fisher Scientific). От трех до шести трансформированных колоний культивировали в 5 мл среды LB, после чего плазмиды очищали с помощью набора GeneJET Plasmid Midiprep Kit (Thermo Fisher Scientific).Очищенные плазмиды секвенировали с помощью Eurofins Genomics.

Анализ последовательности.

Геномные последовательности, содержащие полные кластеры генов α- и β-глобина для императорского пингвина ( A. forsteri ), пингвина Адели ( P. adeliae ), северного глупыша ( Fulmarus glacialis ), полосатого шторма буревестник ( Hydrobates castro ), южный гигантский буревестник ( M. giganteus ), нелетающий баклан ( Nannopterum harrisi ), хохлатый ибис ( Nipponia nippon ) и маленькая цапля ( Egretta Garzetta ). .Кластеры генов α- и β-глобина от оставшихся 19 существующих видов пингвинов были получены из GigaDB (41). Кодирующие последовательности генов α- и β-глобина, выделенные из этих геномных последовательностей, были объединены с вновь созданными последовательностями кДНК, упомянутыми выше ( SI Приложение , рис. S2). Последовательности выравнивали с помощью MUSCLE (42), а затем использовали для оценки филогенетических деревьев, как описано ранее (40). Вкратце, наиболее подходящая модель замены кодонов и начальный поиск по дереву были оценены с использованием IQ-TREE с параметрами -st CODON, -m TESTNEW, -allnni и -bnni (43, 44).Затем исходные деревья были подвергнуты повторной загрузке 1000 мкл trafast (45). Деревья консенсуса начальной загрузки ( SI, приложение , рис. S3) использовались для оценки предковых последовательностей глобинов с использованием IQ-TREE с опцией -asr ( SI, приложение , рис. S2 и S4).

Выборочные анализы.

Мы проверили селекцию в эволюции генов α- и β-глобина пингвинов в рамках модели максимального правдоподобия с моделями на основе кодонов, реализованными в программе codeml из PAML v4.9 сюиты (46), используя описанные выше филогенетические деревья. Мы использовали модели сайта ветвления и клады для изучения вариаций ω, отношения скорости несинонимичных замен на несинонимичный сайт, dN, к скорости синонимичных замен на синонимичный сайт, dS. Мы использовали модель участка ответвления A (47, 48) для проверки положительного отбора в ответвлении, соединяющем AncPro с AncSphen (стволовая линия пингвинов) ( SI, приложение , таблица S2), и использовали модель клады C (49) для тест для отбора в кладу пингвинов с использованием M2a_rel от Weadick и Chang (50) в качестве нулевой модели ( SI Приложение , Таблица S3).

Молекулярное моделирование.

Структурное моделирование было выполнено на сервере SWISS MODEL (51) с использованием Hb серого гуся в окси-форме (код PDB ID 1FAW). AncPro Hb и AncSphen Hb имели значения QMEAN –0,61 и –0,65 соответственно. Среднеквадратичное расстояние (RMSD) основной цепи между значениями шаблона и модели <0,09 Å считалось пригодным для использования (52). Структурный анализ и подготовка графики были выполнены с использованием системы молекулярной графики PyMOL, версия 2.3.2 (Schrödinger).Листинг водородных связей был выполнен с использованием скрипта PyMOL list_hb.py (Роберт Л. Кэмпбелл, биомедицинские и молекулярные науки, Королевский университет). Энергия связи интерфейса рассчитывалась сервером ePISA (53).

Построение векторов экспрессии Hb.

Реконструированные предковые глобины были синтезированы с помощью GeneArt Gene Synthesis (Thermo Fisher Scientific) после оптимизации нуклеотидных последовательностей в соответствии с предпочтениями кодонов E. coli . Кассета синтезированного гена глобина была клонирована в пользовательскую векторную систему pGM вместе с геном метионинаминопептидазы (MAP), как описано ранее (54).Мы разработали замену Thrβ119Ser путем амплификации цельной плазмиды с использованием мутагенных праймеров и ДНК-полимеразы Phusion High-Fidelity (New England BioLabs), фосфорилирования полинуклеотидкиназой T4 (New England BioLabs) и циркуляризации с помощью набора NEB Quick Ligation Kit (New England BioLabs). . Все этапы сайт-направленного мутагенеза выполнялись с использованием протокола, рекомендованного производителем. Каждая плазмида была проверена секвенированием ДНК компанией Eurofins Genomics.

Экспрессия и очистка рекомбинантного гемоглобина.

Экспрессия рекомбинантного гемоглобина

осуществлялась в штамме E. coli JM109 (DE3), как описано ранее (15, 54, 55). Лизаты бактериальных клеток загружали в анионообменную колонку HiTrap SP HP (GE Healthcare), а затем уравновешивали 50 мМ Hepes / 0,5 мМ EDTA (pH 7,0) и элюировали линейным градиентом от 0 до 0,25 М NaCl. Затем Hb-содержащие фракции загружали в катионообменную колонку HiTrap Q HP (GE Healthcare), уравновешенную 20 мМ трис-HCl / 0,5 мМ ЭДТА (pH 8,6), и элюировали линейным градиентом pH от 0 до 0.25 М NaCl. Фракции элюированного гемоглобина концентрировали с использованием центробежных фильтров Amicon Ultra-4 (EMD Millipore).

Подготовка проб для O

₂ Кривые равновесия.

Свежую цельную кровь разводили 1:15 собственной плазмой каждого человека, и сразу после отбора пробы измеряли кривые равновесия O ₂ . Для получения очищенного гемолизата 100 мкл центрифугированных эритроцитов добавляли к 5-кратному объему 0,01 M Hepes / 0,5 мМ буфера EDTA (pH 7,4) с последующей 30-минутной инкубацией на льду для лизирования красных кровяных телец.Добавляли NaCl до конечной концентрации 0,2 М, и образцы центрифугировали при 20 000 × g в течение 10 мин для удаления остатков клеток. Супернатанты гемолизата и очищенный рекомбинантный Hb обессоливали аналогичным образом, пропуская через обессоливающую колонку PD-10 (GE Healthcare), уравновешенную 25 мл 0,01 М Hepes / 0,5 мМ EDTA (pH 7,4). Элюаты концентрировали с использованием центробежных фильтров Amicon Ultra-4 (EMD Millipore). Из этих концентрированных образцов растворы Hb (0,1 мМ Hb в 0,1 М Hepes / 0.05 M EDTA-буфер) были приготовлены в отсутствие (очищенный) и в присутствии 0,1 M KCl и 0,2 мМ инозитол гексафосфата (+ KCl + IHP). Обработки очищенным и + KCl + IHP были приготовлены при трех различных значениях pH (всего шесть обработок на образец Hb). Рабочие растворы доводили с помощью NaOH до pH, максимально близкого к 7,2, 7,4 или 7,6, а затем точно измеряли pH с помощью pH-метра Orion Star A211 и комбинированного pH-микроэлектрода Orion PerpHecT ROSS (Thermo Fisher Scientific).

Измерение O

₂ – Связующие свойства.

O ₂ кривых равновесия измеряли с использованием системы связывания кислорода крови (BOBS; Loligo Systems) при 37 ° C. PH образцов цельной крови устанавливали путем измерения кривых в присутствии 45 торр CO ₂ , тогда как pH растворов Hb устанавливали с помощью буфера Hepes (см. Выше). Каждый образец цельной крови и раствор Hb последовательно уравновешивали множеством напряжений кислорода (PO ₂ ), в то время как поглощение образца непрерывно контролировали при 430 нм (пик дезокси) и 421 нм (точка изобестической окси / дезокси).Каждый этап уравновешивания считался завершенным, когда оптическая плотность при 430 нм стабилизировалась (от 2 до 4 минут). В последующих анализах использовались только значения PO ₂ , дающие от 30 до 70% насыщения Hb O ₂ . Графики холма (log [фракционное насыщение / [1 – фракционное насыщение]] по сравнению с logPO ₂ ) были построены на основе этих измерений. К этим графикам была подобрана линейная регрессия, которая использовалась для определения PO ₂ при половинном насыщении (P ₅₀ ) и коэффициента кооперативности (n ₅₀ ), где интервал x и наклон регрессии линии представляют P ₅₀ и n ₅₀ , соответственно.Значения для образцов цельной крови ( n = 3) представлены как среднее ± стандартная ошибка. Для растворов гемоглобина линейная регрессия была подобрана для графиков зависимости logP ₅₀ от pH, и полученное уравнение использовалось для оценки значений P ₅₀ при pH 7,40 (± SE оценки регрессии).