Пугачева почему так похудела: Похудение Аллы Пугачевой: было и стало (слухи и реальность) | Мода в деталях

Похудение Аллы Пугачевой: было и стало (слухи и реальность) | Мода в деталях

Алла Пугачева похудевшая

Алла Пугачева похудевшая

ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРЕ

В последнее время Алла Пугачева радует поклонников стройной фигурой. Начиная с 2017 года, она сбросила 20 кг! Знаменитая певица всегда была женщиной в теле. Она была предрасположена к полноте: при росте 1,62 м ее вес порой достигал 90 кг. Стараясь замаскировать полноту, на сцене она носила платья-балахоны.

Ниже вы увидите Аллу Пугачеву до и после похудения, и узнаете секреты диеты, которую она применяла.

Помните Аллу Пугачеву такой?

Сначала вы увидите, как Алла Борисовна выглядела не так уж давно. Были периоды, когда она худела, но вес возвращался снова. Наконец, в 2017 году примадонна сумела достичь желанного результата, и до сих пор ей удается удерживать вес неизменным (новый образ певицы см. ниже).

Алла Пугачева в прежнем образе

Алла Пугачева в прежнем образе

Такой результат стал возможным благодаря тщательно продуманному рациону. По словам Аллы Пугачевой, секрет ее похудения прост: «Как мало для этого надо — просто меньше жрать. Кушать хочется, но нельзя!», — говорит певица. Однако она признается, что любит вкусно поесть и иногда это себе позволяет.

Алла Пугачева до похудения

Алла Пугачева до похудения

Диета Аллы Пугачевой для похудения

Близкая подруга Пугачевой Алина Редель рассказывает, что Алла изменила свой рацион с помощью диеты, которую она сама придумала.

Свой принцип Пугачева назвала «СССР». Аббревиатура расшифровывается так: запрещены три «С» — сладкое, сдобное, соленое. А буква «Р» означает разгрузочный день, во время которого певица питается овощными супчиками или легкими салатами.

По словам Алины Редель, изредка Алла может съесть за компанию кусочек торта, но зато потом проводит два разгрузочных дня.

Примадонна в прежнем весе

Примадонна в прежнем весе

Правила для успешного похудения

Принципы, которые использовала Аллы Пугачева:

• Питаться 5-6 раз в день, малыми порциями.
• Ежедневно выпивать 2 л чистой воды.
• Последний прием пищи должен быть не позднее, чем за 3 часа до сна.
• Каждый день 30-40 минут делать физические упражнения (или заниматься любыми видами фитнеса)

Мифы о способах похудения Пугачевой

Однако слова примадонны и ее близких не устраивают некоторых «почитателей». Одни из них утверждают, что певица провела процедуру липосакции, другие — что она сделала резекцию желудка (хирургическое уменьшение объема). Они говорят об этом так, как будто сами при этом присутствовали:)
Близкие артистки опровергают эти утверждения. Например, крестная ее младших детей, а также ее стилист уверяют, что это домыслы, и на самом деле Алла Борисовна сбросила вес благодаря изменению питания и ограничениям в еде, которых она придерживается.

Алла Пугачева со стройной фигурой

Алла Пугачева с новой, стройной фигурой

Алла Пугачева с новой, стройной фигурой

«Не можешь достичь результата? Обесценивай чужой»

И все же некоторые «почитатели» продолжают утверждать, что все дело в липосакциях, резекциях и больших деньгах. «Вот если бы у нас были такие деньги, тогда мы бы тоже могли!…».

Такое явление хорошо известно в психологии. Если человек не может чего-то достичь, он придумывает причины, обесценивающие чужие достижения, так ему легче.

Изменения стиля примадонны

Наверное, вы заметили, что после похудения у Пугачевой полностью изменился стиль. Раньше она одевалась совсем иначе (вы видели это на фотографиях до похудения). А сейчас Алла Борисовна стала одеваться модно, стильно, современно. Она уже не носит бесформенные платья-балахоны, вместо них она предпочитает узкие джинсы, лосины, облегающие юбки. Стройная фигура это позволяет.

Другие истории похудения знаменитостей читайте в статьях — ссылки на них см. в конце.

Главное — мотивация, и все получится

Чтобы избавиться от лишнего веса, главное — иметь мотивацию. Почему голливудские актрисы быстро худеют или поправляются, если это необходимо для роли? Ответ прост: приглашение на съемки в фильме сулит высокие гонорары, а если повезет, то и номинацию на Оскар. Потому актрисы садятся на жесткие диеты и сбрасывают вес к нужному сроку. У них есть сильная мотивация!

Была ли мотивация для похудения у Аллы Пугачевой? Конечно. Когда у женщины молодой муж, она стремится хорошо выглядеть, чтобы красиво смотреться вместе.

Алла Пугачева после избавления от лишнего веса

Алла Пугачева после избавления от лишнего веса

Читайте по теме:

Похудение российских звезд — было и стало

Звездное похудение: Ирина Дубцова — было и стало

Похудение звезд: Елена Степаненко — было и стало (вот это результат!)

Подписывайтесь на канал, ставьте лайки, читайте мнения!

Андрей Разин рассказал, как Алла Пугачева похудела на 20 килограммов за два месяца

14:15, 03.08.2018

У артистов один и тот же диетолог.

Несмотря на то, что Алла Пугачева называет себя «старой больной женщиной», в свои 69 лет она не перестает удивлять общественность то тем, как ей удалось похудеть, то стильными образами. За последние несколько лет Примадонна заметно постройнела и посвежела, и теперь регулярно выходит в свет в нарядах, подчеркивающих ее фигуру. Оказалось, что у певицы есть свой диетолог, который тщательно следит за ее рационом. Услугами этого же специалиста воспользовался и создатель «Ласкового мая» Андрей Разин.

«Он помог Алле Борисовне, когда она была очень полной. Врач периодически приводил ее в форму, с ним она теряла за два месяца более 20 кило. Под присмотром этого диетолога я нахожусь около месяца и уже скинул 6 кг. И еще мой брат (он у меня фармацевт) нашел у нашей покойной бабушки (из моей приемной семьи) рецепт «похудательного» чая. Диетолог Пугачевой посмотрел этот рецепт и сказал: «Уникальная схема, разрешаю!» В сентябре мне исполняется 55 лет, к этому времени я надеюсь скинуть еще минимум шесть кило», — поделился Разин.

Алла Пугачева за два месяца похудела на 20 килограммов

По словам музыканта, ничего неординарного в их с Примадонной диете нет. «Прием пищи по чуть-чуть и по часам. Причем продукты должны быть желательно белковыми. После шести часов вечера диетолог мне запрещает есть. Ну и в день выпиваю полтора литра воды», — рассказал Андрей Разин «КП».

Кстати, буквально две недели назад Андрей Разин обвинил Аллу Пугачеву и Валерия Леонтьева в плагиате. Продюсер заявил, что артисты украли у него песни. По словам Разина, судиться с коллегами он не стал только потому, что Пугачева и Леонтьев исполнили эти композиции хуже, чем он.  Что именно сподвигло Андрея Разина на публичное выяснение отношений, неизвестно.

Андрей Разин

Читайте также:

Алла Пугачева поехала с семьей в Европу, чтобы получить вид на жительство

4-летняя дочь Максима Галкина и Аллы Пугачевой спародировала циркового атлета

4-летние дети Максима Галкина и Аллы Пугачевой устроили для родителей концерт

Как Похудела Пугачева на Самом Деле

Кто из женщин не мечтает иметь стройную фигуру без обвисших складок жира и растянутой кожи? Надежду на новый образ дает появляющаяся в последнее время на экране телевизоров самая известная примадонна эстрады, эпатажная Алла Пугачева. Как похудела звездочка, желают знать миллионы представительниц слабого пола.

Страсти вокруг Пугачевой

Пожалуй, только ленивый не обсуждает ее жизнь с молодым мужем, рождением детей, обретшую третью молодость и стройность. Ходят разговоры, что Алла Борисовна сумела сбросить почти пять десятков веса за последний год. Мало того, ведь похорошела к тому же. Да, завидовать есть чему. Но все ли так, как говорят и показывают? Как похудела Алла Пугачева на 51 кг, пытаются узнать все журналисты женских изданий.

Активизировались сразу же мошенники, готовые поживиться на желании женщин стать похожими на Аллу. Почему бы не бросить «белую косточку» в толпу? Главное — сделать это вовремя, энергично, с общим ажиотажем. Тут же нашлись чудо-диетологи, якобы готовые поделиться секретами пугачевской диеты для всех женщин. Но тут же напоминают: хочешь быть красивой и стройной — плати. А стоит такое удовольствие немалых денег.

Готовы поделиться мыслями о волшебном воздействии «25 кадра». Решили вспомнить Кашпировского, с его мифологическим вещанием с экранов телевизора о всеобщем выздоровлении? Народ у нас доверчивый, стоит только во все уши дуть о средствах похудения. Ну и не грех напомнить, что бесплатным ничего не бывает, всего-то несколько сотен тысяч. Да, красота требует жертв, особенно финансовых. Такими финансами владеют лишь звезды, как Алла Пугачева. Как похудела Примадонна по-настоящему, попытаемся разобраться сейчас.

Аттракцион невиданного похудения

Возвращаясь к образу Аллы Борисовны, можно заметить, что ее гардероб существенно изменился. Когда-то созданные талантливым кутюрье В. Зайцевым балахоны для Аллы, скрывавшие ее формы, ушли в небытие. Их заменили короткие, обтягивающие наряды, совершенно другого модельного ряда. Остается только любоваться сияющим лицом Примадонны и ее новыми формами. Весьма заметно похудевшая Алла Пугачева. Фото до и после красуются во всех печатных изданиях.

В ответ досужим корреспондентам Алла с присущей ей резкостью и юмором бросает короткие фразы, что просто избавилась от холодильника. Это стало поводом к появлению сплетен, мифов о диетах певицы, которыми она пользовалась. Тем более что число желающих уверовать в сказку никогда не убывает. Так почему бы не заработать на этом?

Мифы про огурцы и уголь

Оказывается, Пугачева несколько месяцев просидела на огуречной диете, а запивала огурчики рассолом. День за днем огурцы творили чудо, килограммы уходили как в сказке.

Целый курс предлагался по предложению одной из диет — поглощению активированного угля в особых дозах. Очевидно, сподвигла на такой шаг авторов диеты дешевизна самого средства. Пугачева Алла Борисовна похудела явно не от этих двух продуктов.

Скрытые картинки – еще один миф

Самый эффектный видеокурс «25 кадр». Обещание, что любая женщина, посмотревшая приобретенный курс, тут же перестанет полнеть, начнет худеть и совсем скоро превратится в тростинку. В пример для подражания опять-таки выставляется Алла Пугачева. Как похудела звезда, волнует многих, а другие просто делают деньги на этом.

В рекламных роликах людям обещают безумные рекорды, если следовать методикам. Осталось только купить диски с видеокурсом и просматривать каждый день до результата. Быстроменяющиеся картинки вызывают головокружение, особенно у людей, склонных к припадкам или со слабым вестибулярным аппаратом. Человек входит в определенный транс, который ему подсказывает подсознание. Естественно, не имея рядом специалиста или психолога, можно серьезно навредить своей психике.

Внимание! «25 кадр» не поможет вам в похудении, а только навредит здоровью!

Но почему-то никто не думает о том, что резкое похудение, тем более на 50 кг, ведет к нарушению здоровья, особенно у тех, кто им не избалован. Как известно, Примадонна страдала серьезными сердечными заболеваниями, мало того, была проведена операция в кардиологическом центре.

На прием к диетологу!

Авторы мифа стали рассказывать о рублевской клинике, где певица и ее муж не пожалели отвалить несколько миллионов, чтобы лечь под экспериментальную лазерную липоксацию. Но как известно, лазер не убавляет вес и не ведет к похудению. Липоксация может только воздействовать на излишки жира и растянувшуюся кожу. За один сеанс липоксации удаляется не более 4-6 кг локальных жировых отложений. Как похудела Алла Пугачева на 51 кг – спрашивают многие дамы и даже мужчины.

Есть, конечно, способ постройнеть после бандажирования желудка. Но прооперировать и установить бандаж можно только при общем наркозе, который дается по показаниям лечащего врача. У Аллы Пугачевой здоровье не позволит провести такие манипуляции.

Какая методика похудения была избрана для Пугачевой?

Дискуссионные мифы отпадают. Но никто не отрицает визуального похудения певицы. Так что же за методы использовались?

Косметологические корректировки. Лицо, конечно, тоже прошло обработку у профессиональных косметологов. Сейчас существует немало методик, используемых в аппаратной косметологии, делающих чудеса на лицах, не прибегая к пластическим операциям. Это может быть методика по омолаживанию Софтлифтинг в инъекциях; нитевая подтяжка по линиям овала лица. Все эти и другие процедуры малотравматичны и неопасны для здоровья. Комплексно корректировала свои формы Алла Пугачева. Как похудела звезда, может похудеть каждая дама с лишними средствами.

Стилист добавил последний штрих в новый образ примадонны. Совершенно другой фасон одежды, высокие каблуки, зауженные джинсы, появились пояса, подчеркивающие талию. Так сформировался образ новой Пугачевой, гораздо более выигрышный, оттого и кажется, что Алла сбросила 51 кг.

Хотите похудеть? Полюбите себя для начала, займитесь спортом, правильным питанием, активным образом жизни, и ваш организм отблагодарит вас.

Диета Примадонны: как похудела Пугачева на самом деле

Чуть больше года назад примадонна русской эстрады Алла Борисовна Пугачева удивила всех своим волшебным перевоплощением – она существенно похудела, стала появляться на людях не в закрытых бесформенных балахонах, как раньше, а в коротких открытых платьях и обтягивающих брюках. Судя по последним фото известной певицы, лишнего веса она сбросила приличное количество, но как похудела Пугачева на самом деле, точно не знает никто. Существует много версий внезапного преображения звезды, но какая из них ближе к истине?

Сколько весит Алла Пугачева сейчас

Вес Аллы Борисовны никогда не был стабильным – стрелки звездных весов всегда двигались в диапазоне от 75 до 90 кг. Это не так много, но и не мало, поэтому все привыкли видеть певицу в свободной мешковатой одежде, скрывающей изъяны фигуры и лишний жирок на знаменитом теле. Неожиданно на экранах телевизоров и на страницах всевозможных печатных изданий появляется худая Пугачева, которая резко постройнела до 65 килограммов, да еще и существенно помолодела. Все в недоумении: как похудела Алла Пугачева?

Почему так сильно похудела Алла Пугачева

Феерическое похудение Пугачевой сразу же вызвало большую шумиху в прессе и на телевидение, поэтому, как грибы после дождя, среди всех, интересующихся персоной знаменитости, стали появляться всевозможные сплетни по этому поводу. Если верить слухам о том, почему похудела Пугачева, можно выделить несколько версий столь неожиданного преображения:

1. Переход на правильное питание или строгая диета.
2. Медикаментозное похудение с помощью различных препаратов для борьбы с избыточным весом.
3. Пластическая хирургия для удаления лишнего жира с тела.
4. Хорошая работа стилистов, которые научили Аллочку одеваться правильно – подобрать гардероб так, чтобы скрыть свои проблемные места.

Однако ни одна из версий не достоверна потому, что не подтверждена самой виновницей всего этого ажиотажа – примадонна и ее ближайшее окружение чудодейственный способ похудения Аллы Борисовны держат в большом секрете.

Диета

Диетологи твердят, что эффективное похудение на 70% зависит от питания, поэтому многие поклонники звезды уверены, что Алла Пугачева похудела благодаря разумной корректировке привычного рациона. Разные источники приписывают звезде разные диеты – кремлевскую, кефирно-огуречную, низкоуглеводную. Сама же примадонна в одном из своих интервью оговорилась, что для того, чтобы похудеть, она просто начала питаться правильно: перестала употреблять соль, сахар и все продукты с их содержанием, вместо них полюбила свежие фрукты и овощи, а еще начала контролировать объемы порций.

Липосакция

Вторая версия о чудесном перевоплощении звезды из тучной престарелой женщины в стройную помолодевшую дюймовочку гласит, что Аллочка могла так быстро измениться только после пластики. Почему быстро? Потому, что с отвесом 25 кг и подтянутой, упругой кожей она вернулась в Россию спустя после трех месяцев пребывания в Израиле. Эксперты похудения скажут, что сбросить вес только на правильном питании, пусть даже с активными ежедневными тренировками, за такой короткий срок просто нереально. Да еще в возрасте под 70!

Однако факт остается фактом – примадонна стала худая, причем выглядит существенно моложе своих биологических лет. Как похудела Пугачева на самом деле – остается загадкой. Версия о липосакции хоть и очень правдоподобная, но тоже недостоверная. Наши врачи удивляются, как могла столь немолодая женщина перенести многочисленные операции бесследно, не навредив здоровью, поэтому очень сомневаются в данном способе похудения Аллы Борисовны.

Одежда

Мнения о волшебном похудении звезды с помощью диет и всевозможных достижений медицины имеют право на жизнь. Однако вполне реалистичным выглядит также заявление стилистов о том, что Пугачева просто научилась правильно одеваться. Они твердят, что для того, чтобы скорректировать фигуру и замаскировать проблемные зоны, звезда постоянно носит утягивающее белье и правильно подбирает одежду, акцентируя внимание на достоинствах – стройных ногах и изящной шее, а талию часто подчеркивает пояском. Какая бы из версий ни была самой правдивой, но худоба и молодость примадонне очень идут!

Какой диеты придерживалась Алла Пугачева? Как похудела Алла Пугачева на самом деле?

Не успела вся страна свыкнуться с мыслью о молодом муже Пугачевой и детишках, как тут же Алла предстала перед своими поклонниками невероятно стройной и помолодевшей. Нет сомнений, изменения в облике певицы ошеломляющие. Папарацци неустанно пополняют журналы и интернет-статьи многочисленными снимками, где запечатлена посвежевшая и похудевшая Алла Пугачева. Фото до и после попытались сравнить поклонники ее семьи неоднократно, предполагая, что звезда избавилась от 10, 20 и даже 50 кг.

Осторожно, обман!

Удивляет совершенно не тот факт, какой вес сбросила Алла Пугачева, как похудела, а то, что произошли эти метаморфозы за пару-тройку месяцев без помощи пластической хирургии. О таком успехе мечтают сотни женщин разных возрастов, чем и оперативно воспользовались недобросовестные рекламодатели и владельцы фирм по продаже продуктов для похудения.

И вот уже тысячи сайтов публикуют якобы «правдивый» способ похудения от Пугачевой, предлагая доверчивым читателям приобретать методики 25-го кадра, волшебные ягоды, кремы, пилюли и кофе, которые она использовала в своей диете. Стоимость таких продуктов, естественно, баснословная, но доказанной эффективности не наблюдается. Примадонна неоднократно призывала своих поклонников не верить в эту рекламу.

Способ похудения Примадонны

В своем интервью Алла Пугачева как похудела не скрывает, и рассказывает журналистам, что распрощалась с 20 килограммами не с помощью докторов и «чудо-таблеток». Звезда сама для себя разработала способ питания, который именуется СССР. Никакой аналогии между названием диеты и далеким советским прошлым нет. Расшифровывается аббревиатура так: Сдобное, Сладкое, Соленое, Разгрузка. Суть проста — ограничить себя в первых трех «С» и выделять один день для разгрузки.

Алла Пугачева похудела (фото ее кажутся результатом хорошего фотошопа), не консультируясь с диетологами. Как говорит сама певица: «У каждой женщины внутри есть способность самостоятельно определять свои потребности, что из еды вредно, а что полезно. И чудеса здесь ни при чем». Поэтому, пользуясь правилами диеты СССР, необходимо руководствоваться собственными ощущениями и желаниями.

Как быть со сладким и соленым?

Алла Пугачева, как похудела, признается, что отказ от сладкого и сдобного дался ей достаточно легко, поскольку в таких продуктах она себя ограничивала давно, но вот с соленой пищей было все гораздо сложнее. Кристина Орбакайте, стремительно пришедшая в форму после второй беременности, посоветовала маме ограничивать потребление соли постепенно. Сама Кристина благодаря бессолевому рациону сбросила 10 кг за короткий промежуток времени. Несмотря на такую сложность, полностью отказываться от потребления соленой пищи не намерена похудевшая Алла Пугачева. Последние фото заставляют убедиться в результативности диеты СССР.

Правила диеты СССР

Первая неделя диеты должна пройти под эгидой полного отказа от соленой пищи. Как известно, соль удерживает излишки воды в организме, что ведет к отекам, повышенной нагрузке на сердечные мышцы. Как только объем поступающей соли уменьшается, излишки воды быстро покидают организм, потому первый результат уже будет заметен через 5-7 дней. Как такового чувства голода быть не должно, утверждает Алла Пугачева. Как похудела она, если рацион такой ограниченный?

Количество приемов пищи в такой диете не ограничено, но объем съеденной пищи должен быть небольшим, чтобы не перегружать ЖКТ. Пить чистую воду можно и нужно! Задерживаться она теперь не будет, ведь хлорида натрия не будет в съеденной пище.

Отдельное внимание необходимо уделить потреблению фруктов, овощей — основной доле рациона звезды. Обязательно в ежедневном рационе должны быть белки — мясные продукты, яйца и творог.

Важно помнить, что сладкая и сдобная пища под строгим запретом. В крайних случаях разрешено съедать 1-2 кусочка черного подсушенного хлеба.

Обычно будние приемы пищи Примадонны проходят в режиме ССС. Через каждые три дня она делает разгрузочный день для своего организма. Но если вдруг Пугачеву приглшают на торжество, она себя не ограничивает ни в одном гастрономическом блюде, но здесь есть обязательное условие — 2 следующих друг за другом дня разгрузки.

Разгрузка по диете СССР

Суть дня разгрузки заключается в употреблении продуктов, которые практически не имеют в составе углеводов и трансжиров. Один рецептов для разгрузки — коктейль. Для его приготовления потребуется маложирный кефир, свежий огурец, петрушка и укроп. Все ингредиенты измельчаются в блендере и смешиваются между собой. Пропорциональное содержание ингредиентов: 1 л кефира, 1 средний огурец и небольшой пучок зелени.

Коктейль можно заменить на салат. Ингредиенты те же, только кефир заменяется на легкую сметану. После употребления салата необходимо выпить стакан воды. Запрещено съедать вместе с салатом хлеб, сдобу.

Польза и вред диеты СССР

Исходя из объективной оценки того, как похудела Алла Пугачева, можно сделать вывод, что у диеты СССР прослеживается щадящий режим сброса веса, причем от большого употребления фруктов и овощей организм насыщается витаминами и полезными микроэлементами.

Чтобы не навредить себе, Пугачева Алла похудевшая, фото которой поражают, рекомендует не отказываться от соленой пищи на длительный промежуток времени, даже если результат будет долгое время незначительным.

Придерживаться способа питания СССР можно на протяжении всей жизни, изредка позволяя себе сладкое и слабосоленую пищу. Главное, чтобы при соблюдении правил не возникало проблем с самочувствием.

Можно ли в праздники не придерживаться СССР?

В новогодние праздники, да и в любые другие, Примадонна не намеревается следовать собственной диете, планируя приготовить для семьи традиционные блюда к праздничному столу: сельдь под «шубой», оливье, холодец, рыбу. Однако в отношении алкоголя Пугачева строга, на столе его точно не будет.

На вопросы журналистов Пугачева Алла, похудевшая, фото подтверждают этот факт, и посвежевшая, отвечает лишь одно: «Секрет моей внешности в том, что у меня есть самое главное — любовь, а для каждой женщины это самое главное».

Как на самом деле похудела Пугачёва на – 51кг? в закладки 3

В 2015 году российская примадонна Алла Борисовна Пугачева удивила своих поклонников стремительным похудением за довольно короткий период времени. В то время ходило множество слухов, касательно того, что скорей всего здесь не обошлось без вмешательства хирурга, ведь сбросить примерно 51 килограмм за год задача не из легких.

Сама примадонна категорически отрицает, эти доводы и просит оставить их для жёлтой прессы. Давайте поговорим о том, как на сам деле удалось похудеть знаменитой певице.

Как худела Алла Борисовна?

Помощником примадонны в похудении стал один из ее знакомых, который специализируется в диетологии. Первым делом он посоветовал поп-диве исключить из рациона питания все вредные продукты, содержащие в себе огромное количество жиров, например: хлебобулочные продукты, колбасы, жирное мясо, постепенно примадонна от него категорически отказалась.

Как уверяет Алла Борисовна, самое главное в похудении, это пережить первые две недели, потому, что они являются самыми тяжелыми, так как организм привыкает к лишениям привычных продуктов питания.

Начав свое поэтапное похудение, уже в скором времени рацион певицы составлял двухразовое питание, утром и в 6 часов вечера, на обед, из-за плотного графика, у нее не оставалось времени.

Меню знаменитой женщины состояло из рыбы, круп, овощей и фруктов из них она готовила низкокалорийные и разнообразные блюда, что в свою очередь было вкусно и полезно, также при своей диете примадонна употребляла ежедневно большое количество жидкости, воды или не сладкий зеленый чай.

Диета Аллы Пугачевой

Как уверяет примадонна, самыми главными диетами в ее жизни, являются гречневая и огуречная.

Меню огуречной диеты:

Завтрак: салат из огурцов и зеленого лука, заправленный сметаной или натуральным йогуртом, также можно кусочек черного хлеба из твердых сортов помола и зеленый, несладкий чай.

Обед: йогурт не жирный или стакан кефира, мелко нарезанные огурцы с зеленью, можно к ним добавить, по желанию, одну Помидорку или редис, кусок приготовленной на пару рыбы, и не сладкий чай.

Ужин: Легкий салат из зелени и огурцов, и стакан кефира.

Перед сном можно выпивать стакан кефира, это поможет избежать, ощущение голода.

Сидеть на такой диете нужно не больше одной недели, так как организм истощается и злоупотребление «Огуречной диетой» может привести к печальным последствиям, но в плане очищения организма, диета на огурцах станет отличным вариантом.

Гречневая диета

Завтрак: Гречневая каша, приготовленная на молоке.

Обед: 200 гр. гречневой каши и кусочек рыбы, приготовленной на пару, кусок черного хлеба, не сладкий зеленый чай.

Ужин: Гречневая каша с кусочком огурца.

Гречневой диеты можно придерживаться в любое удобное для вас время, она безвредная и насыщенная полезными свойствами. Помимо гречки можно употреблять в пищу рис, овощи и фрукты.

»

Отличная статья 0

Как похудела Алла Пугачева, новая диета и что стало с Пугачевой после диеты

Известная примадонна российской эстрады дает надежду каждой женщине, желающей сбросить лишний вес. Она заметно похудела в таком возрасте, и это ставит в тупик многих врачей-диетологов. Да и только ленивый еще не обсудил ее личную жизнь с молодым мужем, маленькими детьми и стройной фигурой.

Насколько похудела Алла Пугачева?

Примерно лет десять назад Пугачева не могла позволить носить себе обтягивающие джинсы и брюки. В объемных балахонах она смотрелась более чем полной, и именно поэтому решилась взяться за себя. Теперь, похудевшая Пугачева утверждает, что избавилась за несколько месяцев от 25 килограммов! Многие ее фанаты и антифанаты, считают что лишний вес ушел по единственной причине – липосакции, но на такие заявления примадонна не обращает никакого внимания.

Многих интересует, как похудела Алла Пугачева и не принесло ли это ей проблем со здоровьем. Совсем недавно она рассказала, благодаря чему похудела и, как оказалось, в этом не было ничего удивительного. Она выбрала для себя программу строгого питания, основанную на огурце. С помощью нее она и похудела на 7 килограммов за неделю.

Диета Аллы Пугачевой

За свою жизнь королева российской эстрады испробовала множество различных способов для похудения. Но только именно последнее время, она стала выглядеть еще моложе, ее походка изменилась, а в гардеробе появились короткие платья и джинсы. Результатом этого изменения стала огурцовая диета Пугачевой. Основной продукт для рациона – огурец, который содержит в себе массу полезных веществ, таких как:

• витамины А, В, С, Е;
• фосфор;
• кальций;
• магний;
• хлор;
• калий;
• натрий;
• железо.

Благодаря им, организм за короткий период проводит полную чистку от вредных токсинов, нормализует обмен веществ и ускоряет процесс потери веса. Огурец является основным продуктом в данном методе, но можно включать морковь, яблоки, персики, салатные листья, тыкву, фасоль, капусту, болгарский перец, зелень и маложирные молочные продукты.

Меню огуречно-кефирной диеты выглядит так:

Диета Пугачевой СССР

По словам певицы, данный способ похудения ей нравится больше всех, так как является не слишком строгим. Его посоветовала примадонне собственная дочь, которая рассталась с 12 килограммами, набранными во время родов. Диета СССР Пугачевой, меню которой полностью исключает из рациона сладкое, соленое и сдобное, но в обязательном порядке подразумевает разгрузочный день. Как утверждает сама певица, разгрузочный день помогает омолаживанию и очищению организма.

Диета Аллы Пугачевой на кефире

Еще один реальный метод, как похудела Алла Пугачева – кефир. Этот продукт называют звездным, ведь его с большим удовольствием употребляет большинство известных личностей. Пугачева очень похудела, устраивая для себя разгрузочные дни на этом молочном продукте. За сутки можно выпивать полтора литра, разделяя его на несколько приемов примерно через три – четыре часа. В него можно добавлять:

• различные специи, кроме соли;
• мелко порубленную зелень.

Новая диета Пугачевой

На самом деле новым этот способ назвать сложно. Его использовали уже многие знаменитости, но для певицы он стал новым. Имбирная диета Пугачевой Аллы Борисовны помогла ей похудеть на 10 килограммов за месяц. Рацион включает в себя заранее приготовленный напиток, который нужно принимать в течение определенного времени. Имбирь отлично сжигает жиры, поэтому он и присутствует практически в любом диетическом меню и входит в список ингредиентов данного напитка, в состав которого входят:

• сок лимона;
• корень имбиря;
• мед;
• вода.

Приготовление:

1. Корень нужно мелко порезать и залить литром кипятка (желательно в термосе).
2. Добавить туда ложку меда и столько же лимонного сока.
3. Принимать его необходимо за 30 минут перед каждым приемом пищи.
4. В дополнение к этому следует исключить сладости и жирную еду.

Что стало с Пугачевой после диеты?

Слухи вокруг примадонны не утихают, но она привыкла не обращать на них внимания. Похудевшая Алла Пугачева считает, что стиль ее жизни и здоровье никак не изменились и то, что она похудела, пошло ей только на пользу. Как говорит сама певица, если есть для кого стараться, то можно изменить многое. Чем лучше одевается певица – тем больше разговоров о похудении, чем лучше выглядит – тем больше говорят о подтяжке лица. По ее словам, женщина в таком возрасте должна аккуратно подбирать гардероб, максимально скрывающий недостатки, а помолодевшее лицо – результат длительной работы стилиста и косметолога.

Как сейчас выглядит певица, после похудения?

Внешние изменения в ней заметны невооруженным взглядом. Гуляя под руку с мужем, никто не скажет о значительной разнице в возрасте. Худоба сама по себе сильно омолаживает женщину, делает ее более грациозной и легкой. Последнее фото Пугачевой после похудения с легкостью передает настроение звезды. Полученный результат ей очень нравится, что она не скрывает. Стоит заметить, что Алла Пугачева похудела, изменив режим сна. Для правильной работы организма и обмена веществ обязательно хорошо высыпаться. Не стоит поздно ложиться, чтобы исключить соблазн съесть что-то запрещенное.

Как на самом деле похудела Алла Пугачева? Диета СССР,фото и видео похудевшей Примадонны

#Похудениеиправильноепитание, #Знаменитости

Здравствуйте, уважаемые читатели! Сегодня в нашей статье мы поговорим о способе похудения Примадонны. Мы выясним, как похудела Пугачева на самом деле и как ей удалось сбросить более 20 кг за столь короткий срок. И поделимся с вами диетой и некоторыми секретами, которые помогли певице выглядеть гораздо моложе и стройнее.

Путь к сильному похудению Пугачевой

Публика только успела привыкнуть к появлению в жизни Пугачевой Максима Галкина и двух детишек, как Примадонна шокирует снова. На этот раз предметом всеобщего обсуждения и центром внимания становится новый образ певицы.

Все мы привыкли видеть Аллу Борисовну в просторных балахонах, которые создавал для нее Вячеслав Зайцев. Такие наряды скрывали все недостатки фигуры, которая у певицы не менялась, и вес оставался немаленьким. Но появление звезды эстрады в новом молодежном образе сразу притянуло все взгляды и всколыхнуло общественность.

Пугачева не только значительно похудела, но и посвежела на лицо, что стало заметно даже без макияжа. А также внешне сбросила несколько десятков лет.

Разницу можно легко заметить. Прежняя Алла и нынешняя, как два разных человека. Ей удалось сбросить минимум двадцать кг. Девушки заинтересовались и желали достичь таких же перемен. Многие начали строить разные версии того, что же стало причиной этого, приписывали звезде даже то, что она чем-то больна.

Однако, сама Алла Борисовна не спешит делиться своими секретами. Но журналистам удалось выяснить их от близкого окружения Примадонны. Так с помощью чего ей удалось так измениться?

• Сокращение количества приемов пищи. Похудевшая Пугачева теперь кушает только два раза в день: завтрак и ужин.
• Соблюдение диеты. Певица не обращалась к диетологам. А сама составила для себя подходящий режим питания. Она считает, что каждая женщина должна самостоятельно понимать свой организм. И знать, что ему нужно. Что принесет пользу, а от чего нужно отказаться в первую очередь. Звезда составляет для себя меню, исходя из своих ощущений.
• Липосакция. По словам источника, Примадонна воспользовалась данной процедурой, потому как без нее было не обойтись. Певица была долгое время в большом весе.
• Утягивающее белье. То, что делает стройной любую девушку и визуально создает практически идеальную фигуру. И певица воспользовалась такой хитростью.
• Смена стиля в одежде. Немаловажный фактор — это гардероб девушки. Если одежда подобрана с умом, то она подчеркнет все ваши достоинства и скроет недостатки. Именно с таким критерием теперь выбираются вещи для певицы. Балахоны сменились молодежными джинсами, короткими и обтягивающими платьями.

Все, что мы перечислили и позволило звезде эстрады выглядеть гораздо выигрышнее, моложе и стройнее. Имидж певицы изменился до неузнаваемости. Это можно заметить на фотографиях до и после похудения, с изображением прежней и постройневшей Аллой Пугачевой.

Фото похудевшей Аллы Пугачевой

Сейчас последние фото:

Диета Аллы Пугачевой

Друзья, если вы уже сгораете от любопытства и жаждете узнать, каким способом можно сбросить вес, как знаменитая Примадонна, то запаситесь терпением и вскоре все узнаете. Звезда поделилась, что название ее авторской диеты весьма интересное: СССР. Но связи с советским прошлым никакой нет. Расшифровывается довольно просто: Сдобное, Сладкое, Соленое, Разгрузка. То есть вы должны запретить себе те самые три «С» и делать один день разгрузки для организма.

Напомним, что звезда не обращалась к диетологам, значит вы должны руководствоваться только собственными желаниями и прислушиваться к своему организму.

Алла Пугачева призналась, что были некие трудности при соблюдении режима в самом начале. Она легко смогла отказаться от сдобной и сладкой еды. Но запретить себе потребление соленой пищи было сложно.

По совету своей дочери, которая после вторых родов быстро привела себя в отличную форму, Примадонна постепенно уменьшала количество потребляемой соли. И снизила ее суточную дозу до минимума. То есть, если вы не можете исключить продукт полностью, то минимизируйте его потребление насколько это для вас возможно.

Читайте также:

• Возможно ли похудеть после 60 лет? Елена Степаненко раскрывает секреты о том, как она похудела на самом деле

Правила и меню СССР

Девушки, сейчас мы подскажем вам главные правила диеты СССР, которые помогли самой Пугачевой скинуть лишние килограммы.

• Первая неделя похудения — это полный отказ от соли. Вы должны полностью исключить ее из своего рациона хотя бы на первое время. Соль удерживает воду в организме, от чего появляются отеки. Когда вы уменьшите количество потребляемой соли, вода начнет уходить из организма.
• Приемы пищи не ограничены по количеству. Главное, девушки, помните, что ваши порции должны быть небольшими! Ведь есть нужно меньше, но чаще.
• Пейте больше воды. Это пойдет на пользу организму, особенно при полном отказе от соли. Ведь вода больше не будет задерживаться в организме.
• Ешьте больше фруктов и овощей, и делайте запрет на выпечку. Вы можете лишь побаловать себя пару раз в неделю кусочком черного хлеба. Не забывайте про белковые продукты.
• Через каждые три дня у вас должен быть день разгрузки. Вы не должны употреблять углеводы и трансжиры.

Помимо вышеперечисленных правил Алла Борисовна рекомендует не забывать и про спорт. Чтобы тело оставалось подтянутым, живот и бока уходили, ему необходима физическая нагрузка.

Каковы главные секреты Примадонны?

Звезда эстрады всем дает совет, как можно меньше потреблять пищу, а больше пить воды и двигаться. Певица твердо считает, что в возрасте старше пятидесяти лет, большую роль играет сущность человека. Нужно избавляться от уныния, плохого настроения, пессимизма.

Алла Борисовна призывает спокойнее относиться ко всем проблемам, а не погружаться в них с головой. Ведь мы прекрасно понимаем, что человека старит уныние. Если вы будете постоянно зациклены на своих неудачах, то ваша внешность быстро станет непривлекательной, а заедание проблем скажется лишними цифрами на весах.

За долгое время на сцене звезда добилась огромных успехов. Стала популярной, ее хиты знает каждый житель России и не только. Она заслужила невероятную любовь публики. А в последнее время заслуживает восхищения, благодаря большим стараниям над собой и сменой образа. Помолодевшая и похудевшая Пугачева радует всех своей привлекательной внешностью.

Вдобавок ко всему посмотрите на video-рецепт гречневой диеты от звезды:

Заключение

Итак, вам нужно запомнить:

• Вы уже узнали, что на самом деле метод, на котором похудела Алла Пугачева, называется СССР. Расшифровывается, как — Сладкое, Сдобное, Соленое, Разгрузочный день. Первые три «С» — то, что нужно исключить. И через каждые три дня устраивать разгрузочный день без углеводов и вредных жиров.
• Ешьте чаще, но меньшими порциями.
• Пейте больше воды. Когда вы исключите соль, она не будет задерживаться в организме и вызывать отеки.
• Кушайте больше овощей, фруктов и белковой пищи.
• Делайте хотя бы легкие физические упражнения, чтобы держать свое тело в тонусе.
• Для того, чтобы визуально придать вашему телу стройности, используйте утягивающее белье и правильно подобранный гардероб.

Ну вот, уважаемые друзья, и закончилась наша статья. Помните, что мы будем благодарны, если вы нажмете на кнопки социальных сетей сбоку или напишите свои результаты похудения в комментариях.

И не забудьте подписаться на канал, впереди будет много интересного и полезного.

До встречи в следующей статье!

Источник: https://desire-girl.ru/poxudenie/diety-zvezd/kak-na-samom-dele-poxudela-alla-pugacheva.html

22 нравится»

Источник: zen.yandex.ru Красота это…

Понравилось? Сохраните себе на стену в соц.сетях или закладках

Кнопки социальных сетей чуть ниже…

Эксперты рассказали, как похудела Алла Пугачева

Многие восхищаются тем, как Пугачева смогла в своем преклонном возрасте похудеть на 20 килограмм. Этим, конечно же, пользуются маркетологи, которые подсовывают наивным покупателям очередную “чудо-пилюлю” якобы от звезды. Так в чем же на самом деле секрет стройной фигуры Примадонны? Об этом передает Clutch.

Подпишись на Знай в Google News! Только самые яркие новости!

Подписаться

В своих интервью Алла Борисовна не любит распространятся о своих методах похудения, но все же если слушать ее внимательно, можно вынести много полезного.

Диета, на которой сидит Примадонна существует, и называется она “СССР”. Такую систему питания придумала сама певица, и суть ее очень проста. Все это вы уже слышали сотни раз: нельзя есть сладкое, мучное и соленое, еще раз в неделю нужно проводить разгрузочный день.

Алла Пугачева всегда готовит себе сама. В ее рационе много овощей и фруктов, а также нежирных кисломолочных продуктов. Она старается пить много воды и постоянно двигается. Пугачева не признавалась, ходит ли на тренировки, но поклонники уверены, что спорт в жизни певицы все же есть.

Популярные статьи сейчас

Показать еще

Примадонна придерживается строгого правила и никогда не ужинает позже 21:00. Также ее уже нечасто увидишь в ночных заведениях, ведь Алла ложится спать не позже 23:00.

Но самый главный секрет похудения Примадонны – это дети. Малышы заставляют певицу постоянно быть в движении, к тому же, они дарят ей положительные эмоции и смех. Это и заставляет Пугачеву почувствовать себя снова молодой.

Некоторые говорят о хирургическом вмешательстве, но на самом деле секрет Пугачевой очень простой: она ведет здоровый образ жизни. Так что чтобы добиться такого же результата нужно просто взять волю в кулах и полностью пересмотреть свой способ жизни.

Напомним, Примадонну российской эстрады Аллу Пугачеву, которой в следующем году исполняется 70 лет, раскритиковали за смелый наряд.

Ранее Знай.ua сообщал, Алла Пугачева в последние несколько лет активно экспериментирует с новыми образами.

Также Знай.ua писал, беременная фанатка откровенно рассказала про секс с Киркоровым.

Подпишись на Знай в Google News! Только самые яркие новости!

Подписаться

Пугачева похудела на 20 кг, перестав быть совой

Алла Борисовна в марте 2016-го. Фото: instagram.com/evgenii_0709

Последние фото Аллы Пугачевой впечатляют: в 66 лет она выглядит моложе и стройнее многих ровесниц. Поклонники гадают: как Пугачевой удалось так радикально похудеть? Сама певица секрета не раскрывает. «Комсомолка» расспросила ее близких и друзей.

Перешили гардероб

– Алла Борисовна старается сейчас правильно питаться, следит за собой. А мы не успеваем ушивать ее наряды, – говорит стилист Аллы Пугачевой Алишер. – Вроде бы недавно сделали для нее вещь, а она звонит: «Надо еще ушить. Мне уже велико это платье». Сам не знаю, что происходит. Вещи сложно перекраивать, потому что они были сшиты на другую фигуру. Вижу, Алла Борисовна вошла во вкус. Теперь она носит джинсы, которые продаются в подростковых отделах – 38 – 40‑го размера. Нижняя часть у нее очень худенькая.

Похоже, Примадонна за последнее время сбросила около 20 килограммов.

И в августе 2011 года.

Фото: Лариса КУДРЯВЦЕВА/ЭГ

Спать в 11 вечера

Домработница Филиппа Киркорова Людмила Дороднова, которая много лет служила в доме у Пугачевой, уверена, что Алла Борисовна прекрасно выглядит, потому что теперь все готовит сама, без помощи поварих.

– Алла любит супчики, особенно овощные, – рассказывает Людмила. – Когда она на диете, ест рыбу. Предпочитает запеченного в фольге окуня. А еще Алла говорила, что хорошо худеть на гречке. С вечера добавляешь в крупу ложку растительного масла, чуть-чуть сахара, соль. Заливаешь кипятком и укутываешь в полотенце. Назавтра можно целый день гречку есть: сытно и полезно.

– Я спрашивала у Аллы Борисовны про диету, но она не рассказывает, – признается крестная мать двухлетнего Гарри (сына Аллы и Максима. – Ред.) дизайнер Мила Ставицкая. – Она, скорее всего, ограничивает себя порциями. Хотя на домашних праздниках ест все, но в меру…

Однако Примадонна похудела не только благодаря правильному питанию. Певица стала больше спать.

Примадонна за последнее время сбросила около 20 килограммов. Фото Виктора Степанова

– Алле посоветовали ложиться спать до 23.00. Мол, таким образом налаживается обмен веществ и килограммы теряешь быстрее, чем на обычной диете, – объяснили «КП» близкие друзья артистки. – Теперь Алла Борисовна нечастый гость на вечерних мероприятиях.

МНЕНИЕ ВРАЧА

Сон для стройности

– Если человек в 23.00 уже в кровати, то достаточно длительный период времени организм будет находиться без питания, – объясняет врач-диетолог Наталья Лазуренко. – Особенно если следовать правилам и ужинать за два часа до отхода ко сну. Тогда идет активный процесс сжигания жировой ткани.

Второй момент – гормональный фон. За регуляцией обменных процессов у взрослых отвечает «гормон роста» – соматропин. Он вырабатывается в организме именно в ночное время. Точнее – начинает около полуночи. И дальше вырабатывается через каждые два-три часа при условии, что человек спит. Поэтому тем, кто худеет, важно ложиться спать до 11 вечера. И, конечно же, желающим постройнеть необходимо выделять для сна не менее 8 часов в сутки.

Алла Пугачева с новой прической стала неузнаваемой

последние несколько лет Алла Пугачева не перестает удивлять поклонников своим внешним видом. Она сильно похудела, сменила стиль одежды с любимых толстовок на молодость. Многие подозревают, что не обошлось и без пары пластических операций. Тем не менее, за 71 год вряд ли каждая женщина сможет выглядеть на 50.

Алла Борисовна вчера снова принимала гостей. Вместе с Максимом Галкиным приехали Юдашкины, Буйновы и еще несколько близких друзей.

По-своему Пугачева снова всех поразила. Для застолья на свежем воздухе она выбрала наряд нежного цвета в горошек – очень похожий на пижаму. Но украшения сделали свое дело: примадонна выглядела настоящей аристократкой и настоящей хозяйкой замка.

Кроме того, из-за жары певица, как обычно, не стала пристегивать шиньон и завивать локоны. Она собрала волосы в “конский хвост”, которого – не на память поклонников – давно не было.

«Какая молодая женщина стала!», «Прическа действительно идет!», «Алуся – молодая женщина!», «Как ты крут, когда открываешь шею и лицо!» – Пугачева засыпали комплиментами фанаты.

Обычно Алла Борисовна уезжает из Москвы с детьми на лето, а Максим Галкин активно гастролирует. Он приходит в семью каждый раз, когда путешествует с концертами и съемками, выделяя хотя бы несколько свободных дней. В прошлом году звездная семья летом жила в Юрмале, а позапрошлое лето провела в Италии.

В 2020 году по понятным причинам никого не осталось. Но пока погода радует жителей Москвы и Подмосковья. Звезды проводят время в своих загородных домах. Ставят бассейны, шезлонги ставят, но по морю все равно скучают.

Но некоторые уже уехали в отпуск. Например, Ксения Бородина с мужем и детьми поехала на Черное море на машине. Лера Кудрявцева и Анфиса Чехова Мы ездили в санаторий в Краснодарский край. 48-летняя Лера призналась, что именно сюда ее в детстве возили родители! Теперь здесь современный сервис и комфортабельные апартаменты.Также есть лечение. Кудрявцева, сдав анализы, обнаружила, что у нее повышенный уровень стресса. Ей назначили массаж и лечебные ванны.

Пугачева вышла в тесном наряде –

Знаменитости, которых не знают после похудения (фото до и после)

Каждая женщина хочет быть стройной, а когда дело касается знаменитостей, вопрос о том, должны ли они всегда быть в форме, даже не обсуждается. Но как сложно заставить себя отказаться от сладкого и даже постоянно проводить время в тренажерном зале, а еще хуже – бегать по утрам.

Но оказалось, что среди российских знаменитостей немало, сумевших взять себя в руки и выйти из борьбы с полновесными победителями.

Посмотрите на наших звезд, которые, похудев, стали еще привлекательнее.

Гагарина Полина

Среди похудевших знаменитостей эта певица занимает первое место, потому что ей удалось снизить вес фактически вдвое, похудев на 40 кг. Чтобы прийти в себя, Полина потратила полгода.Она сменила несколько диет, пока не разработала подходящую диету, основанную на принципах правильного питания, и, конечно же, активно посещала тренажерный зал.

Сегодня хрупкость Гагариной стала ее визитной карточкой, а смена имиджа на фоне великолепного голоса подняла ее до уровня первоклассной звезды.

Настя Каменских

Невероятной популярностью всегда пользовался дуэт Насти и Потапа, в котором не последнюю роль сыграла эффектная внешность Насти – красивое лицо, густые вьющиеся волосы и, главное, соблазнительные роскошные формы, редко встречающиеся в современных стройных моделях.

Не отец пошел: Кристофер Шварценеггер совсем не увлекается спортом

Школьные обеды дорожают: как не оставить ребенка голодным

Лечебные свойства масла, применяемого на курорте Азербайджана

Но в какой-то момент Настя захотела пополнить ряды худеньких девушек и взялась за удаление лишнего веса. Она начала правильно питаться, усиленно занималась спортом, концентрируясь на программе специальных тренировок, и делала это до тех пор, пока существенно не уменьшилась в объеме.А теперь она стала еще красивее.

Дубцова Ирина

У певицы не только отличный голос, но и красивое лицо. Единственное, что ей не нравилось, – это несколько пухленькая фигура, не соответствующая стандартам современного шоу-бизнеса. Но, настроившись на отличный результат, Ирина приложила все усилия, чтобы его добиться. Естественно, главным была смена питания, но немаловажным фактором были занятия спортом, среди которых бокс был ее первым помощником.И сейчас, похудев почти до модельных параметров, певица, чтобы не потерять форму, продолжает заниматься боксом.

Анфиса Чехова

Несмотря на то, что пышные формы этой телеведущей были ее визитной карточкой и привлекали внимание сильного пола, она, глядя на коллег по профессии, решила похудеть. Начав эту нелегкую борьбу в 2016 году, Анфиса за два года похудела на 25 кг, став еще более соблазнительной.Но, что характерно, этому помогла не только диета, но и йога, которой она серьезно увлеклась, когда поняла, что совершенствует не только физически, но и духовно.

Из-за странного грима девушка прославилась как вождь Краснокожих.

Это место, где спят дети из разных уголков мира. Фото
6 нижних юбок: как выглядело нижнее белье в России

Ходченкова Светлана

Если вы сейчас посмотрите на эту актрису, то увидите, что от той пышнотелой русской красавицы, которую Станислав Говорухин увидел впервые и, не задумываясь, предложил ей главную роль в своем фильме «Благослови женщину», ничего не осталось.Несмотря на возражения мастера, Светлана решила приблизиться к современным стандартам и, взяв себя в руки, похудела на 20 кг.

Ирина Пегова

Что касается этой актрисы, то ее никогда нельзя было назвать законченной. Напротив, ее слегка округлые формы и пухлые щеки с милыми ямочками всегда радовали глаз, но… И она поддалась распространявшейся среди звезд мании похудания и кардинально пересмотрела свой рацион. Ирина не только исключила из своего рациона сладкое, мучное и жирное, но и пошла дальше, став вегетарианкой.И вот результат – у нас есть изящная трость!

Сходство принцессы Шарлотты и принцессы Дианы удивляет мир
Борода и усы чемпионата: кадры участников, каждый из которых заслуживает победы
«Вызывающе и неприлично». Модельный бизнес в СССР

Картункова Ольга

Эта всем известная КВНщица прекрасно себя чувствовала в роли великолепной дамы и при росте 169 см весила 150 кг. И она не комплексовала, потому что создала свой неповторимый образ, который идеально подходил для сцен в КВН.Но в 2013 году она неудачно упала, сломала ногу, и по пути быстрого выздоровления ее большой вес увеличился. Начав худеть по рекомендации врачей, Ольга настолько увлеклась этим процессом, что продолжала его даже после того, как начала нормально ходить. И хотя борьба была долгой и сложной, за год ей удалось сбросить 60 кг.

Пелагея

Певица Пелагея была вынуждена пересмотреть свою внешность как из-за новой работы, так и из-за развода с мужем.Правда, сначала процесс похудения был тяжелым, потому что у нее была генетическая предрасположенность к полноте, но… Желание похудеть было настолько сильным, что Пелагея преодолела все трудности. Естественно, пришлось сесть на диету и заняться спортом, но и огромную роль сыграли специально подобранные спа-процедуры, которые в целом превратили ее в элегантную красоту.

Думаю, все будет одинаково: 10 чувств, на которых играют манипуляторы
Остались куриные крылышки? Внешность обманчива: собаки, не похожие на самих себя
Девушка с татуировкой дракона: любопытные факты об Эмилии Кларк

Виктория Лопырева

Известная модель и телеведущая постоянно следит за своим весом.Правда, у нее был период, когда она немного поправилась и отошла от модельных параметров, но продлился он недолго. Виктория быстро привела себя в форму, после чего бросила все силы, чтобы поддержать ее. Ее личная методика – запускать процессы сжигания жира в организме. Для этого она начинает свой день со стакана воды, затем ест часто и медленно и, конечно же, ходит в спортзал несколько раз в неделю.

Алла Пугачева

Уже кто-то, а Примадонна борется с лишним весом практически всю свою жизнь.Она худела и поправлялась, но возникшие проблемы со здоровьем и операция заставили ее всерьез задуматься о похудании, что она и сделала. В Сети можно найти множество диет от Аллы Пугачевой, но, по ее словам, она не строго соблюдала диеты, так как регулярно устраивала кефирные и гречневые разгрузочные дни, а также повышенные физические нагрузки. Результат – минус 20 кг и отличный внешний вид.

Спорный конкурс на участие в конкурсе на Евровидение из России

Манижа Сангин никогда не был типичной российской поп-звездой.

Беженка из Таджикистана и откровенная про-ЛГБТ-феминистка. Мартовский выбор артистки-поп-певицы путем публичного голосования на государственном телевидении для представления ее принятой страны на конкурсе песни Евровидение в этом году в голландском городе Роттердам ошеломил российский музыкальный истеблишмент.

С поворотом России к социальному консерватизму, который усиливается на фоне законов, ограничивающих гомосексуальность и декриминализирующих насилие в семье, 29-летний певец, исполняющий роль Манижи, кажется многим опровержением всего того, что страна отстаивала в Путине. эпоха.

В колонке либеральной газеты «Новая газета», написанной вскоре после выбора Манижи, журналист Вячеслав Половинко охарактеризовал этот выбор как «объявление войны» влиятельным российским традиционалистам.

Манижа – таджикская певица из страны, где мигранты из Центральной Азии регулярно сталкиваются с расизмом и дискриминацией, – никогда не скрывала своих политических взглядов.

Совместив свою музыкальную карьеру с активизмом в защиту беженцев, Манижа выпустила Mama 2019 года, что совпало с запуском SOS-приложения против домашнего насилия.

Ее выбор на «Евровидении» – резонансная площадка для таких просмотров.

В то время как Евровидение рассматривается как лагерь-фестиваль в европейских странах и редко привлекает серьезных артистов, в России оно имеет большой профиль. Участники обычно получают хорошие результаты среди голосующих, а кандидаты от звезд эстрады Филиппа Киркорова и Димы Билана в рейв-группу Little Big добились большого успеха дома.

Манижа представляет собой незнакомый артистический поворот для страны, победившей в конкурсе 2008 года с поп-треком Димы Билана в стиле R&B Believe.

Охватывая арт-поп, хип-хоп и соул, работа Манижи, которая началась в виде пятнадцатисекундных клипов, загруженных в Instagram, а затем переросла в ее дебютный альбом 2017 года Manuscript, не имеет ничего общего с тем, что нравится публике в чарте.

Представленный в уникальной смеси английского и русского языков и включающий все, от акустических русских народных мотивов до госпел-хоров, происхождение Манжи в Таджикистане, которое она оставила в детстве во время постсоветской гражданской войны, является постоянной темой.

В красивом музыкальном клипе на «Недославянку» (Не совсем славянка) 2019 года Манижа представляет карикатурный, штампованный образ жизни в ее родной Средней Азии, торгующейся на базарах, сражаясь с ниндзя и раздавая российские паспорта ученым. -быть иммигрантами.

Это насмешливый тон повторяется в “Русской женщине”, феминистском гимне, который Манижа возьмет в Роттердам, чтобы выиграть второй титул на Евровидении.

Выходя на сцену в традиционном народном костюме, прежде чем снять его, чтобы обнажить красный комбинезон под ним, текст песни отражает самобытный бодипозитивный феминизм, который отличает Манижу в российском культурном истеблишменте, который часто перекликается с государственной риторикой вокруг традиционных ценностей.

«Тебе больше тридцати! Привет?! Где твои дети? В целом ты хорошенькая, но должна похудеть », – говорится в одной строке из песни.

Реакция на песню, обвиняемую в разжигании ненависти к русским мужчинам и женщинам, была неоднозначной.

Две консервативные организации – православная женская группа и ассоциация ветеранов – зарегистрировали юридические жалобы на песню.

Следственный комитет России заявил, что рассматривает жалобу ассоциации ветеранов, в которой утверждается, что песня Манижи разжигает межнациональную рознь.

Реакция на выбор Манижи была неоднозначной: некоторые из видных политических тяжеловесов России, в том числе пресс-секретарь президента Владимира Путина Дмитрий Песков, высказались публично, высмеивая участие России в столь любимом и осмеянном песенном конкурсе.

В марте Валентина Матвиенко, обычно сдержанная председатель Совета Федерации – верхней палаты парламента, – спросила, почему Манижа был выбран представлять Россию.

Во время парламентского заседания Матвиенко официально поручила своему коллеге потребовать разъяснения процедуры отбора у государственного телеканала, ответственного за выбор.

Влиятельные сторонники

Манижа, однако, нашла влиятельных сторонников, в том числе президента ее родного Таджикистана и Аллу Пугачеву, ветерану ведущей российской поп-музыки с советских времен, которая высоко оценила сценическое мастерство Манижи во время выступления на телевидении в марте.

Тем не менее, общественная реакция на скандал вокруг заявки Манижи на Евровидение пока остается сдержанной.

Апрельский опрос, проведенный независимым социологическим агентством «Левада-Центр», показал, что 13% респондентов одобряют выбор Манижи и 18% – не одобряют.Половина респондентов ответили, что им все равно.

Однако, несмотря на безразличие общественности, заявка Манижи на Евровидение привлекает внимание к зачастую маргинализированным этническим меньшинствам в России, считают эксперты.

«Знаменательно, что Россию представляет певец таджикского наследия», – сказал новостному сайту «Реальное время» Дмитрий Опарин, научный сотрудник аналитического центра Института социальной политики.

«Это важно для имиджа России как страны, в которой есть мигранты.”

Роль p53 в гибели клеток и раке человека

Рак (Базель). 2011 Март; 3 (1): 994–1013.

Тошинори Одзаки

¹ Лаборатория противоопухолевых исследований, Научно-исследовательский институт онкологического центра Тиба, 666-2 Нитона, Тюох-ку, Тиба 260-8717, Япония; Электронная почта: pj.cc-abihc@ikazot

Акира Накагавара

² Отдел биохимии и лаборатория инновационной терапии рака, Научно-исследовательский институт онкологического центра Тиба, 666-2 Нитона, Чуох-ку, Тиба 260-8717, Япония

¹ Лаборатория противоопухолевых исследований, Научно-исследовательский институт онкологического центра Тиба, 666-2 Нитона, Тюох-ку, Тиба 260-8717, Япония; Электронная почта: pj.cc-abihc @ ikazot

² Отдел биохимии и лаборатория инновационной терапии рака, Научно-исследовательский институт онкологического центра Тиба, 666-2 Нитона, Чуох-ку, Тиба 260-8717, Япония

^* Автор, которому следует вести переписку адресованный; Электронная почта: pj.cc-abihc@kanarika; Тел .: + 81-43-264-5431; Факс: + 81-43-265-4459.

Поступило 7 декабря 2010 г .; Пересмотрено 22 февраля 2011 г .; Принято 22 февраля 2011 г.

Авторские права © 2011, авторы; лицензиат MDPI, Базель, Швейцария. Эта статья цитировалась в других статьях в PMC.

Abstract

p53 – фактор ядерной транскрипции с проапоптотической функцией. Поскольку более 50% раковых заболеваний человека связаны с мутациями потери функции в гене p53 , p53 считается одним из супрессоров опухолей классического типа. Мутантный р53 действует как доминантно-отрицательный ингибитор р53 дикого типа. Действительно, мутантный p53 обладает онкогенным потенциалом. В некоторых случаях злокачественные раковые клетки, несущие мутации p53 , обнаруживают химиорезистентный фенотип. В ответ на различные клеточные стрессы, такие как повреждение ДНК, р53 накапливается в ядре клетки для осуществления своей проапоптотической функции.Активированный р53 способствует остановке клеточного цикла, что позволяет репарации ДНК и / или апоптозу для предотвращения распространения клеток с серьезным повреждением ДНК посредством трансактивации его генов-мишеней, участвующих в индукции остановки клеточного цикла и / или апоптоза. Таким образом, ДНК-связывающая активность р53 тесно связана с его функцией подавления опухолей. В настоящей обзорной статье мы описываем регуляторные механизмы p53, а также опосредованные p53 терапевтические стратегии для лечения злокачественных опухолей.

Ключевые слова: апоптоз, повреждение ДНК, p53

1.Введение

Клетки постоянно подвергаются различным клеточным стрессам, таким как повреждение ДНК. Эти клеточные стрессы, наконец, вносят геномные аберрации, включая мутации, делеции и / или транслокации, в клеточный геном и тем самым вызывают геномную нестабильность. Накопление геномных аберраций часто приводит к развитию рака [1]. Следовательно, необходим правильный ответ на стресс для поддержания целостности генома и защиты клеток от злокачественной трансформации.

p53 представляет собой фактор ядерной транскрипции и трансактивирует многочисленные гены-мишени, участвующие в индукции остановки клеточного цикла и / или апоптоза [2-5]. В нормальных условиях р53 экспрессируется на чрезвычайно низком уровне, что вызвано протеасомной деградацией, в значительной степени опосредованной убиквитин-протеинлигазой E3 типа RING-finger MDM2 [6-8] и как функционально латентная форма. При повреждении ДНК происходит накопление р53 в ядре клетки посредством посттрансляционных модификаций, таких как фосфорилирование и ацетилирование.Эти химические модификации превращают p53 из латентной в активную форму, что может быть связано с диссоциацией MDM2 от p53 [2-5]. Функционально активный р53 трансактивирует соответствующий набор своих генов-мишеней, чтобы вызвать остановку клеточного цикла и / или апоптоз, что зависит от степени и типов повреждения ДНК [2-5,9]. Опосредованная p53 остановка клеточного цикла позволяет клеткам восстанавливать поврежденную ДНК. Когда репарация ДНК завершается, клетки снова входят в нормальный клеточный цикл. Напротив, когда клетки имеют серьезное повреждение ДНК, p53 проявляет свою проапоптотическую функцию, устраняя клетки с серьезным повреждением ДНК и тем самым ингибируя перенос поврежденной ДНК к дочерним клеткам.Таким образом, p53 обладает способностью поддерживать целостность генома.

Обширные поиски мутаций показали, что более 50% раковых заболеваний человека несут мутации потери функции в гене p53 [10-17], что позволяет предположить, что p53 является классическим супрессором опухолей типа Кнудсона. Действительно, у мышей, дефицитных по р53 и , развился спонтанный рак [18]. Среди них 95% мутаций обнаруживаются в области генома, кодирующей ДНК-связывающий домен р53, и, таким образом, мутантный р53 не обладает способностью к специфической для последовательности трансактивации [4].Способность р53 к трансактивации тесно связана с его проапоптотической функцией [19,20]. Мутантный р53 образует гетероолигомер с р53 дикого типа через их интактные домены олигомеризации и действует как доминантно-негативный ингибитор р53 дикого типа [21,22]. В отличие от короткоживущего р53 дикого типа (20 мин), мутантный р53 имеет длительный период полужизни (от 2 до 12 ч) с онкогенным потенциалом [23-25]. Раковые опухоли, несущие мутации p53 , иногда проявляют химиорезистентный фенотип, что указывает на то, что p53 играет критическую роль в регуляции ответа на повреждение ДНК [26-28].Таким образом, очень важно разработать новую стратегию устранения негативного воздействия мутантного р53 на р53 дикого типа для эффективной химиотерапии.

2. Структурные особенности p53

p53 состоит из трех репрезентативных функциональных доменов, включая NH ₂ -концевой домен кислой трансактивации (TA: аминокислотные остатки 1–45), ДНК-связывающий домен (DB: аминокислотный остатки 102–292) и COOH-концевой домен олигомеризации (OD: аминокислотные остатки 319–359) [2–5].Концевой домен трансактивации NH ₂ подразделяется на два независимых домена, таких как TA 1 (аминокислотные остатки 1-40) и TA II (аминокислотные остатки 43–63) [29,30]. ДНК-связывающий домен связывается с тандемным повторением p53-чувствительного элемента (RRRCWWGYYY: R, G / A; W, A / T; Y, C / T), разделенных до 13 п.н. в промоторных областях его мишени. гены [19]. В ответ на различные клеточные стрессы, такие как повреждение ДНК и энергетический стресс, р53 вызывает остановку клеточного цикла и / или апоптоз за счет трансактивации своих генов-мишеней.Функциональный p53 образует гомотетрамер, который опосредуется его COOH-концевым доменом олигомеризации.

Помимо этих репрезентативных функциональных доменов, p53 содержит несколько характерных доменов, необходимых для его активности. Поскольку р53 является фактором транскрипции, р53 должен быть локализован в ядре клетки. Для эффективного ядерного доступа p53, p53 содержит три сигнала ядерной локализации (NLS, аминокислотные остатки 305–322, 369–375 и 379–384), которые распознаются комплексом importin α / β [31].Дисфункция импортина α приводит к задержке р53 в цитоплазме [32]. Следовательно, импортин α способствует ядерной локализации p53. Альтернативно, p53 содержит богатый Leu сигнал ядерного экспорта (NES, аминокислотные остатки 339–352), распознаваемый механизмом ядерного экспорта CRM1 (обслуживание хромосомной области 1) [31]. CRM1 является членом семейства рецепторных белков карио-ферина-β и был предложен как ключевой фактор, который опосредует ядерный экспорт p53 [33]. Было показано, что образование тетрамера р53 маскирует NES и тем самым ингибирует его ядерный экспорт [34].Напротив, MDM2-опосредованное моноубиквитинирование на COOH-концевых остатках Lys нарушает образование тетрамера p53 и выставляет NES для связывания CRM1 [35]. p53 также имеет Pro-богатый домен (аминокислотные остатки 63–97). Было показано, что этот богатый про-богатым доменом связан с проапоптотической функцией р53 [36,37]. В самом деле, делеция этой обогащенной области приводит к полной потере проапоптотической активности р53.

3. Мутационная инактивация p53

Мутационная инактивация считается одним из наиболее распространенных молекулярных механизмов дисфункции p53.Обширный поиск мутаций показал, что более чем в половине случаев рака человека связаны мутации р53 с потерей функции [16]. Среди них 95% мутаций выявлялись в области генома (экзоны 5–8), кодирующей ДНК-связывающий домен [4]. Тщательное изучение профилей мутаций показало, что шесть аминокислотных остатков наиболее часто мутируют при раке человека, включая Arg-175, Gly-245, Arg-248, Arg-249, Arg-273 и Arg-282 [38]. Эти мутации, обнаруженные в ДНК-связывающем домене p53, нарушают его правильную конформацию, и, таким образом, мутантный p53 имеет дефект в отношении специфической для последовательности активации транскрипции, зависящей от консенсусного элемента p53-связывающего дикого типа.Более того, мутантный р53 проявляет доминантно-негативное поведение по отношению к р53 дикого типа за счет образования гетеротетрамера с р53 дикого типа и обладает онкогенным потенциалом [21,22,25].

Накапливающиеся данные продемонстрировали, что определенные раковые мутантные формы p53 трансактивируют различные гены-мишени, такие как ген множественной лекарственной устойчивости 1 (MDR1), c-myc, ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA), интерлейкин-6 (IL-6). ), инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1), фактор роста фибробластов (FGF) и рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) [39–45].Scian et al. обнаружил, что полученный из рака мутантный p53 трансактивирует аспаргинсинтетазу (ASNS) и обратную транскриптазу теломеразы (TERT) [46]. Следовательно, вполне вероятно, что некоторые мутанты р53, происходящие от рака, трансактивируют стимулирующие рост и онкогенные гены, тем самым приводя к прогрессированию агрессивных раковых образований (2).

Доминантно-негативный эффект мутантного р53 на р53 дикого типа. Проапоптотическая функция p53 значительно подавляется некоторыми мутантами p53, которые вызывают злокачественную трансформацию за счет повышения регуляции c-myc и TERT.

Поскольку поиск мутаций для p53 был сосредоточен на области генома, кодирующей ДНК-связывающий домен, все еще могли иметь место неидентифицированные мутации потери функции вне ДНК-связывающего домена [4]. Lomax et al. обнаружил точечные мутации (L344P и R337C) в COOH-концевом домене олигомеризации p53 [47,48]. Согласно их результатам, р53, несущий мутацию L344P, существовал в мономерной форме и не обладал способностью к трансактивации. С другой стороны, р53, несущий мутацию R377C, образовывал тетрамер, тогда как этот мутант проявлял значительно сниженную транскрипционную и проапоптотическую активность.DiGiammarino et al. сообщил о наличии точечной мутации (R337H) в COOH-концевом домене олигомеризации [49]. р53, несущий мутацию R337H, образовывал нативный тетрамер, однако его стабильность была значительно ниже, чем у р53 дикого типа. Мы обнаружили, что p53ΔC лишен части домена олигомеризации и сигналов ядерной локализации в клеточных линиях, происходящих от нейробластомы человека [50]. Основываясь на наших результатах, p53ΔC в значительной степени экспрессируется в цитоплазме и имеет значительно более низкую проапоптотическую способность по сравнению с p53 дикого типа.Следовательно, мутации p53, обнаруженные вне ДНК-связывающего домена, также вызывают потерю функции p53. С клинической точки зрения необходимо разработать новую стратегию устранения негативного воздействия мутантного р53 на р53 дикого типа. Хотя подавляющее большинство мутантов р53 оказывают доминантно-отрицательное действие на р53 дикого типа, некоторые из мутантов р53, такие как R175P, демонстрируют лишь частичную потерю своей ДНК-связывающей активности [5].

4. Протеолитическая деградация p53

В нормальных условиях уровень p53 поддерживается на довольно низком уровне благодаря системе убиквитин / протеасомозависимой белковой деградации.Убиквитин-протеинлигаза E3 типа RING-finger MDM2 (двойная мышиная минута 2) в значительной степени катализирует этот процесс [6-8]. MDM2 был идентифицирован как один из генов, амплифицированных на двухминутных хромосомах, присутствующих в спонтанно трансформированных линиях мышиных клеток [51]. Поскольку клетки NIh4T3, сверхэкспрессирующие MDM2, являются онкогенными у мышей nude, MDM2 обладает трансформирующим потенциалом [52]. MDM2 связывается с NH ₂ -концевым доменом трансактивации р53 и катализирует добавление убиквитина к кластеру из шести COOH-концевых остатков Lys (Lys-370, Lys-372, Lys-373, Lys-381, Lys-382 и Lys-386) в р53 [53,54].Полиубиквитинированный р53 обнаруживается в клетках, подвергнутых действию ингибитора протеасом [55]. Мутантный p53 ускользает от MDM2-опосредованной протеасомной деградации и накапливается до высоких уровней в раковых клетках [46]. Недавно было описано, что MDM2 обладает функцией постубиквитинирования для деградации p53 [56]. Согласно их результатам, MDM2 усиливает ассоциацию р53 с протеасомой. Lai et al. обнаружил, что MDM2 моноубиквитинирует p53, но не полиубиквитинат p53 [54], предполагая, что может существовать убиквитиновая протеинлигаза E4, которая катализирует полиубиквитинирование p53.Grossmaan et al. сообщил, что р300 с внутренней гистонацетилтрансферазной активностью действует как убиквитин-протеинлигаза Е4 для р53 [57,58].

Поскольку p53 трансактивирует MDM2 , p53 создает отрицательную саморегулирующую петлю обратной связи, в которой p53 индуцирует экспрессию своего отрицательного регулятора MDM2. В дополнение к MDM2, белковые лигазы убиквитина E3 типа RING-finger Pirh3 (p53-индуцированный белок домена RING h3) [59] и COP1 (конститутивный фотоморфогенный 1) [60,61] также взаимодействуют с p53 и опосредуют убиквитин / протеасомозависимый деградация p53 независимым от MDM2 образом.Подобно MDM2, Pirh3 и COP1 ингибируют транскрипционную, а также проапоптотическую функцию p53. Поскольку Pirh3 и COP1 являются продуктами гена-мишени, индуцированными p53, они также участвуют в отрицательной саморегулирующей петле обратной связи, которая контролирует p53. Исследования экспрессии продемонстрировали, что COP1 сверхэкспрессируется в аденокарциномах груди и яичников в сочетании с заметным снижением стабильного уровня p53 [61]. Следовательно, вероятно, что сверхэкспрессия COP1 способствует быстрой деградации p53 при раке и ослабляет функцию p53.С другой стороны, белок, взаимодействующий с p53, названный HAUSP (убиквитин-специфическая протеаза, ассоциированная с вирусом герпеса), обладает внутренней ферментативной активностью по деубиквитинату p53 и, таким образом, увеличивает его стабильность даже в присутствии чрезмерных количеств MDM2 [62].

5. Субклеточное распределение p53

Соответствующее ядерное распределение p53 имеет решающее значение для экспрессии транскрипционной активности, опосредованной p53. Помимо мутационной инактивации р53, аномальная задержка р53 в цитоплазме вызывает потерю функции р53.В отличие от большинства других видов рака, p53 редко мутирует в нейробластоме человека [17]. Ранее Moll et al. обнаружил, что р53 дикого типа в значительной степени экспрессируется в цитоплазме недифференцированной нейробластомы [63], указывая на то, что неспособность ядерной транслокации р53 ослабляет его активность по подавлению опухоли. Аномальная цитоплазматическая локализация р53 также наблюдается при первичном раке груди человека, раке толстой кишки и гепатобластоме [64,65]. Последующие исследования показали, что COOH-концевой участок р53, содержащий NLS, замаскирован в нейробластоме, и добавление короткого COOH-концевого пептида способствует доступу р53 к ядру [64].Интересно, что было показано, что аберрантное гиперубиквитинирование р53 способствует его задержке в цитоплазме в нейробластоме [66].

Николаев и др. открыл большой цитоплазматический белок, названный Parc (p53-связанный, паркин-подобный цитоплазматический белок) [67]. Согласно их результатам, NH ₂ -концевая область Parc взаимодействовала с COOH-концевой областью p53. Parc обладал внутренней активностью E3-убиквитин протеин-лигазы, однако Parc оказывал незначительное влияние на стабильный уровень экспрессии p53.Примечательно, что Parc был связан с большей частью цитоплазматического p53 и действовал как цитоплазматический якорный белок для p53. siRNA-опосредованный нокдаун Parc в нейробластоме привел к увеличению химиочувствительности p53-зависимым образом.

Mihara et al. обнаружил, что в ответ на повреждение ДНК часть р53 перемещается из ядра клетки в митохондрии раковых клеток, подвергающихся апоптозу [68]. Внутри митохондрий р53 непосредственно способствует проницаемости внешней митохондриальной мембраны, образуя комплексы с BclXL и Bcl2 и тем самым высвобождая цитокром с в цитоплазму.Дополнительные исследования продемонстрировали, что MDM2-опосредованное моноубиквитинирование p53 способствует его митохондриальной транслокации, где p53 подвергается быстрому деубиквитинированию митохондриальным HAUSP, генерируя апоптотически активный неубиквитинированный p53 [69]. Подавление HAUSP приводит к повышению устойчивости к апоптозу, вызванному повреждением ДНК, в сочетании с подавлением митохондриальной транслокации р53 [70]. Таким образом, нацеливание p53 на митохондрии, которое вызывает дисфункцию митохондрий, может быть одним из независимых от транскрипции проапоптотических путей, опосредованных p53.

6. Продукты гена-мишени, отвечающие за p53

Поскольку р53 осуществляет свою биологическую функцию через продукты гена-мишени, очень важно идентифицировать продукты гена-мишени p53, а также выяснять их функциональное значение. В этом разделе мы описываем функциональное значение репрезентативных продуктов гена-мишени p53.

Ингибитор клеточного цикла p21 был открыт четырьмя независимыми исследовательскими группами. Эль-Дейри и др. идентифицировал p21 ^WAF1 (p53-активированный фрагмент 1 дикого типа) как ген-мишень для p53 [71]. p21 ^WAF1 промотор гена содержит два p53-чувствительных элемента, и его генный продукт подавляет рост клеток. Harper et al. обнаружил p21 ^CIP1 (белок, взаимодействующий с Cdk) как белок, связывающийся с Cdk2 (Cyclin-зависимая киназа 2) [72]. p21 ^CIP1 прочно связывается с Cdk2 и ингибирует его протеинкиназную активность, блокируя фосфорилирование опухолевого супрессора pRB (продукт гена восприимчивости ретинобластомы). Xiong et al. сравнил субъединичный состав комплексов Cdk / cyclin между нормальными и трансформированными клетками и обнаружил, что p21 часто теряется из мультипротеинового комплекса, полученного из трансформированных клеток [73].В качестве альтернативы, Noda et al. идентифицировал p21 ^SD1 с помощью скрининга экспрессии в стареющих диплоидных фибробластах человека [74]. p21 ^SD1 (ингибитор стареющих клеток) блокирует синтез ДНК и поддерживает фенотип старения. Теперь мы называем его p21 ^WAF1 . В ответ на клеточные стрессы p53 индуцирует остановку клеточного цикла G1 за счет активации p21 ^WAF1 .

Hermeking et al. описал, что отрицательный регулятор клеточного цикла 14-3-3σ индуцируется в ответ на повреждение ДНК р53-зависимым образом и участвует в индукции остановки G2 / M [75].Дальнейшие исследования показали, что 14-3-3σ противодействует Mdm2-опосредованной деградации p53 и ядерному экспорту p53 [76]. Ohki et al. открыл новый продукт гена-мишени p53, названный Reprimo [77]. Репримо – это сильно гликозилированный цитоплазматический белок, который вызывает задержку G2. Аналогичным образом, Tanaka et al. выделил p53-индуцируемый генный продукт, названный p53R2, со значительным сходством последовательности с малой субъединицей рибонуклеотидредуктазы (R2) [78]. Последующие исследования показали, что p53R2 индуцируется в ответ на различные повреждения ДНК и вызывает остановку G2 / M.

p53 строго поддерживается на чрезвычайно низком уровне в нормальных условиях. MDM2 нацелен на p53 для опосредованной убиквитином / протеасомой деградации [6-8]. Барак и др. сообщил, что MDM2 является одним из генов-мишеней транскрипции р53 [79]. Таким образом, MDM2 участвует в отрицательной саморегулирующей петле обратной связи, которая контролирует уровень экспрессии p53.

Поскольку р53-зависимый апоптоз опосредуется митохондриальной дисфункцией, р53-индуцибельные митохондриальные белки представляют особый интерес.Мы описываем здесь BAX (Bcl2-ассоциированный X-белок), p53AIP1 (p53-регулируемый апоптоз-индуцирующий белок 1), NOXA (латинское «повреждение») и PUMA (p53-модулятор апоптоза, активирующий апоптоз). Selvakumaran et al. обнаружил, что BAX (Bcl2-ассоциированный X-белок) является немедленным ранним геном, чувствительным к p53 [80]. BAX обычно распределяется в цитоплазме или слабо связан с митохондриальной мембраной. При стимуляции апоптоза BAX индуцируется конформационным изменением с последующим образованием встроенных в мембрану гомоолигомеров, что приводит к пермеабилизации внешней митохондриальной мембраны и высвобождению цитохрома c из межмембранного пространства митохондрий в цитозоль [81].Ода и др. идентифицировал p53AIP1 как один из продуктов гена-мишени p53 [82]. p53AIP1, который локализован в митохондриях, способствует апоптозу, влияя на потенциал митохондриальной мембраны и тем самым высвобождая цитохром c [83]. p53-зависимая активация p53AIP1 тесно связана с фосфорилированием p53 по Ser-46. NOXA был заново открыт с помощью метода дифференциального отображения [84]. NOXA индуцируется в ответ на повреждение ДНК р53-зависимым образом. Было показано, что два домена (домен Bh4 и домен нацеливания на митохондрии) в Noxa важны для высвобождения цитохрома с из митохондрий [85].PUMA был идентифицирован как один из продуктов гена-мишени p53 [86,87]. PUMA обнаруживается исключительно в митохондриях и связана с Bcl2, способствующим выживанию, через свой домен Bh4. PUMA вызывает апоптоз из-за дисфункции митохондрий. Jeffers et al. обнаружил, что BAX необходим для PUMA-опосредованного апоптоза, помещая BAX ниже PUMA [86].

7. Посттрансляционные модификации

При повреждении ДНК р53 индуцируется на уровне белка и проявляет свою транскрипционную, а также проапоптотическую функцию в сочетании с химическими модификациями, такими как фосфорилирование и ацетилирование [2-5].p53 фосфорилируется по Ser-15, Ser-20 и Ser-46 в ответ на повреждение ДНК. NH ₂ -концевое фосфорилирование p53 способствует диссоциации MDM2 от комплекса p53 / MDM2 и тем самым превращает p53 из латентной в активную форму [89]. Напротив, протеинфосфатазы PP-1 и PP2A дефосфорилируют p53 и отрицательно модулируют его активность [90,91]. Следовательно, событие фосфорилирования, вызванное повреждением ДНК, играет решающую роль в регуляции стабильности, а также активности р53. Ser-15 фосфорилируется ATM (мутация при атаксии-телеангиэктазии) [92], ATR (мутация при атаксии-телеангиэктазии и связанная с Rad3) [93], Chk1 (киназа контрольной точки 1) [94] и DNA-PK (ДНК-зависимая протеинкиназа) [95].Ser-20 фосфорилируется Chk2 (контрольная киназа 2) [96] и Plk3 (поло-подобная киназа 3) [97]. Было показано, что HIPK2 (протеинкиназа 2, взаимодействующая с гомеодоменом) и PKCdelta (протеинкиназа C-дельта) участвуют в фосфорилировании p53 по Ser-46 [98,99]. Среди них фосфорилирование p53 по Ser-46 тесно связано с его проапоптотической функцией.

Помимо NH ₂ -концевого фосфорилирования p53, p53 также фосфорилируется в его COOH-концевой области. CKII (казеинкиназа II) фосфорилирует p53 по Ser-392 [100] и PKC фосфорилирует p53 по Ser-371, Ser-376 и Ser-378 [101].Эти COOH-концевые фосфорилирования р53 усиливают его ДНК-связывающую активность [2-4]. В нормальных условиях COOH-концевой участок p53 маскирует его ДНК-связывающий домен в латентной конформации и действует как негативный регулятор [102,103]. Поскольку обработка антителом против p53 распознает COOH-концевую часть p53 или усечение COOH-концевой части p53 приводит к значительному увеличению его ДНК-связывающей активности [102]. Напротив, мы обнаружили, что митотический регулятор Plk1 (поло-подобная киназа 1) ингибирует транскрипционную и проапоптотическую активность p53 посредством физического взаимодействия и фосфорилирования [104].Таким образом, фосфорилирование р53 не всегда действует как сигнал активации.

p53 также ацетилируется в ответ на повреждение ДНК [2-4]. Ацетилирование, вызванное повреждением ДНК, опосредуется p300, который действует как повсеместный коактиватор транскрипции [105]. p300 взаимодействует с NH ₂ -концевой областью p53 и опосредует ацетилирование кластера COOH-концевых остатков Lys (Lys-370, Lys-372, Lys-373, Lys-392 и Lys-381) [5]. Sakaguchi et al. продемонстрировал, что PCAF (связанный с p300 / CBP фактор), другой гистоновый ацетил-переносчик, ацетилирует Lys-320 р53 в ответ на повреждение ДНК [106].Следует отметить, что эти COOH-концевые остатки Lys также являются сайтами-мишенями для лигирования убиквитина. Таким образом, ацетилирование р53 снижает уровни его убиквитинирования за счет конкуренции между ацетилированием и убиквитинированием. Действительно, p300-опосредованное ацетилирование p53 приводит к увеличению его стабильности и усилению его транскрипционной, а также проапоптотической активности [107]. В соответствии с этим представлением Michishita et al. описал, что SIRT1 (гомолог 1 регуляции информации 2 типа молчащего спаривания), который обладает внутренней деацетилазной активностью, взаимодействует с p53 и ослабляет p53-зависимую остановку клеточного цикла, а также апоптоз в ответ на повреждение ДНК посредством деацетилирования Lys-382 [108 ].Kawai et al. сообщил, что p300 играет двойную роль в регуляции стабильности p53 [109]. Основываясь на их результатах, p300 стабилизировал p53 в присутствии более низкого уровня MDM2, тогда как p300 способствовал MDM2-зависимой протеасомной деградации p53 в присутствии более высокого уровня MDM2. Это может быть связано с активностью р300 убиквитин протеинлигазы Е4 [57]. Для решения этой проблемы необходимо провести дальнейшие эксперименты.

8. Взаимодействие белок-белок

Некаталитическое взаимодействие белок-белок – один из механизмов регуляции функции p53.В этом разделе мы описываем репрезентативных партнеров по связыванию р53, которые регулируют функцию р53.

Среди 14-3-3 членов семьи 14-3-3σ действует как положительный регулятор для p53 [76]. Экспрессия 14-3-3σ не обнаруживается при раке груди человека, раке желудка и гепатоцеллюлярной карциноме [110-112], что позволяет предположить, что потеря 14-3-3σ имеет решающее значение в развитии рака. p53 взаимодействует с COOH-концевой областью 14-3-3σ (аминокислотные остатки от 153 до 248), и это взаимодействие оказывает положительное влияние на стабильность p53, блокируя MDM2.Кроме того, 14-3-3σ облегчает образование тетрамера р53 и усиливает его транскрипционную активность [76].

ASPP1 и ASPP2, которые содержат анкилиновые повторы, Sh4-домен и Pro-богатый домен, взаимодействуют с p53 и специфически усиливают проапоптотическую активность p53 за счет ингибирования выживания Bcl2 [113]. Понижающая регуляция ASPP1 или ASPP2 приводит к снижению чувствительности к CDDP. Как и ожидалось, ASPP1 и ASPP2 увеличивают рекрутирование p53 на промотор BAX и усиливают транскрипционную активность p53.С функциональной точки зрения, ASPP1 и ASPP2 значительно усиливают p53-опосредованную трансактивацию проапоптотических генов-мишеней, таких как BAX и PIG-3 (p53-индуцибельный ген 3), тогда как ASPP1 и ASPP2 усиливают p53-зависимую трансактивацию. генов-мишеней p53, участвующих в остановке клеточного цикла в меньшей степени. Уровни экспрессии ASPP1 и ASPP2 значительно снижены при раке груди человека по сравнению с уровнями соответствующих нормальных тканей. Таким образом, нарушение регуляции ASPP1 и ASPP2 способствует развитию рака груди.

Iwabuchi et al. идентифицировал 53BP1 как нового партнера по связыванию р53 [114]. 53BP1 связывается с центральной областью р53 (аминокислотные остатки 80–320). В отличие от р53 дикого типа, 53BP1 не взаимодействует с мутантами р53, происходящими от рака (R175H и R273H). Последующие исследования показали, что 53BP1 усиливает активацию транскрипции, опосредованную p53 [115]. Rappoid et al. обнаружил, что 53BP1 быстро фосфорилируется ATM в ответ на повреждение ДНК и образует дискретные ядерные фокусы, содержащие фосфорилированный вариант гистона h3AX (γh3AX).γh3AX локализуется в местах разрывов цепи ДНК. Следовательно, 53BP1 тесно участвует в раннем сигнальном пути повреждения ДНК [116].

Мы ранее идентифицировали NFBD1 (ядерный фактор с доменом 1 BRCT) / MDC1 (медиатор белка 1 контрольной точки повреждения ДНК) с антиапоптотической функцией [117]. Дальнейшие исследования показали, что NFBD1 взаимодействует с γh3AX через свои COOH-концевые домены BRCT и рекрутирует комплекс MRN (MRE11, Rad50 и NBS1) на участки повреждения ДНК для облегчения эффективной репарации ДНК [118-120].Подобно 53BP1, NFBD1 также участвует в регуляции реакции на повреждение ДНК. Действительно, NFBD1 -дефицитные мыши обнаруживают хромосомную нестабильность, дефекты репарации ДНК и чувствительность к радиации [121]. Недавно мы обнаружили, что р53 взаимодействует с NFBD1 [122]. Согласно нашим результатам, NFBD1 связывается с NH ₂ -концевой областью р53 и ингибирует АТМ-опосредованное фосфорилирование р53 по Ser-15 для защиты клеток от апоптоза во время ранней фазы ответа на повреждение ДНК. Во время поздней фазы ответа на повреждение ДНК p53 диссоциировал от комплекса p53 / NFBD1 и фосфорилировался по Ser-15, чтобы проявить свою проапоптотическую функцию.

RUNX3 является одним из членов семейства генов, связанных с Runt ( RUNX ), и считается кандидатом в супрессоры опухолей при раке желудка человека [123,124], однако остается неясным, как RUNX3 выполняет свою функцию супрессора опухолей. Мы обнаружили, что RUNX3 взаимодействует с p53 и усиливает его транскрипционную, а также проапоптотическую активность [125]. Основываясь на наших результатах, siRNA-опосредованный нокдаун RUNX3 привел к значительному снижению чувствительности к противораковому препарату в p53 -профильных клетках, но не в p53 -дефицитных клетках, предполагая, что может существовать функциональное взаимодействие между RUNX3. и p53 в ответ на повреждение ДНК.Следует отметить, что нокдаун RUNX3 ослабляет ATM-зависимое фосфорилирование p53 по Ser-15 в ответ на повреждение ДНК. Таким образом, RUNX3 привлекает фосфорилированные формы ATM к p53 и тем самым активирует p53 ().

Функциональное взаимодействие между p53 и RUNX3. При повреждении ДНК RUNX3 связывается с фосфорилированной формой ATM (p-ATM) и рекрутирует ее на p53, чтобы облегчить фосфорилирование p53 по Ser-15.

9. Варианты форм p53

Долгое время считалось, что человеческий p53 кодирует единственный белок размером 53 кДа.Инь и др. заметил присутствие относительно меньшего по размеру белка (47 кДа), который обнаруживался моноклональным анти-p53 антителом, названным PAb 421 (эпитоп: аминокислотные остатки 372 и 382) [126]. Дальнейшие исследования показали, что этот белок 47 кДа распознается моноклональным антителом против p53 1801 (эпитоп: аминокислотные остатки 46 и 55), но не моноклональным антителом против p53 DO-1 (эпитоп: аминокислотные остатки 20- 25) и DO-13 (эпитоп: аминокислотные остатки 26-35). При тщательном изучении NH ₂ -концевых аминокислотных остатков р53 они обнаружили второй сайт инициации трансляции в Met-40.Таким образом, они пришли к выводу, что этот белок 47 кДа генерируется альтернативной инициацией трансляции и назван p53 / 47. Поскольку p53 / 47 лишен NH ₂ -концевого участка связывания MDM2, он не нацелен на протеасомную деградацию, опосредованную MDM2. Кроме того, p53 / 47 обладает способностью образовывать гомотетрамер и гетеротетрамер с полноразмерным p53. Как упоминалось выше, NH ₂ -концевой домен трансактивации р53 разделен на два субдомена, ТА 1 и ТА II. p53 / 47 не имеет домена TA I, но сохраняет домен TA II.Последующие исследования показали, что p53 / 47 не способен трансактивировать p21 ^WAF1 , тогда как он может предпочтительно увеличивать экспрессию MDM2, GADD45 и BAX . Эти наблюдения предполагают, что домены ТА I и ТА II по-разному трансактивируют гены-мишени р53.

Помимо альтернативного продукта трансляции р53, Bourdon et al. описал, что p53 человека кодирует несколько вариантов, возникающих в результате альтернативного сплайсинга и использования альтернативного промотора [127, 128].Согласно их результатам, они обнаружили внутренний промотор в интроне 4 человеческого p53 с помощью стратегии, основанной на GeneRacer PCR. Наконец, они обнаружили усеченный на конце NH ₂ вариант, инициированный с кодона 133 (Δ133p53), отличного от p53 / 47. Δ133p53 лишен NH ₂ -концевого домена трансактивации и Pro-богатого домена. Они расширили свое исследование, чтобы идентифицировать другие вариантные формы р53 с помощью ОТ-ПЦР. Они обнаружили, что событие альтернативного сплайсинга интрона 9 приводит к генерации p53β и p53γ, которые удаляют COOH-концевой домен олигомеризации.В совокупности человеческий p53 кодирует p53, p53β, p53γ, Δ133p53, Δ133p53β, Δ133p53γ, Δ40p53, Δ40p53β и Δ40p53γ. Δ40p53 соответствует p53 / 47 (). Согласно их результатам, p53β был локализован в основном в ядре клетки, тогда как p53γ обнаруживался как в ядре клетки, так и в цитоплазме. Кроме того, Δ133p53β экспрессируется как в ядре клетки, так и в цитоплазме; однако Δ133p53γ был обнаружен только в цитоплазме. Обширные исследования экспрессии показали, что варианты p53 экспрессируются в большом количестве нормальных тканей человека, но тканезависимым образом.Кроме того, не было обнаружено опосредованное повреждением ДНК накопление p53β и Δ133p53β. Интересно, что Δ133p53 был обнаружен в 24 из 30 случаев первичного рака молочной железы. Поскольку Δ133p53 действует как доминантно-негативный ингибитор р53 дикого типа, возможно, что Δ133p53 участвует в развитии рака молочной железы, несущего р53 дикого типа.

Структура вариантов р53. ТА, домен трансактивации; DB, ДНК-связывающий домен, специфичный для последовательности; OD, домен олигомеризации. Также показаны расчетные молекулярные массы.

10. Р53-опосредованная терапия

Терапевтическая эффективность противораковых агентов сильно зависит от их способности запускать апоптоз в раковых клетках-мишенях [129]. Поскольку р53 играет ключевую роль в регуляции судьбы клеток в ответ на повреждение ДНК, необходимы терапевтические стратегии, которые активируют опосредованный р53 проапоптотический путь и / или устраняют доминантно-негативный эффект мутантного р53 на р53 дикого типа. .

Как упоминалось выше, MDM2 связывается с NH ₂ -концевой областью р53 и ингибирует его транскрипционную, а также проапоптотическую функцию.MDM2 также способствует протеасомной деградации p53. Таким образом, антагонист MDM2 может активировать p53 и предложить новый терапевтический подход к раку. Василев и др. открыл первый мощный и селективный низкомолекулярный ингибитор связывания p53-MDM2, названный Nutlin [130]. Согласно их результатам, Nutlin связывался с MDM2 в p53-связывающем кармане и блокировал взаимодействие между MDM2 и p53, что приводило к стабилизации p53, а также к активации p53-опосредованного проапоптотического пути в раковых клетках, несущих дикого типа. р53 .В дополнение к Nutlin было показано, что M1-219, который действует как ингибитор MDM2, может быть одним из многообещающих агентов для реактивации p53 [131]. Виталий и др. описал, что короткий пептид, полученный из COOH-концевой области p53, содержащей Parc-связывающий домен, нарушает взаимодействие между Parc и p53 [132]. Обработка этим пептидом вызвала перемещение р53 в ядро ​​и повысила чувствительность к противораковым препаратам при раковых заболеваниях, таких как нейробластома с цитоплазматическим р53 дикого типа.

Альтернативно, повторная активация мутантного p53 способствует гораздо более эффективному лечению злокачественных опухолей, несущих мутантный p53 . После скрининга библиотеки низкомолекулярных соединений Bykov et al. обнаружил, что одно соединение, названное PRIMA-1, обладает способностью восстанавливать функцию дикого типа мутантного p53, такого как R248Q и R175H [133]. Дальнейшие исследования продемонстрировали, что PRIMA-1 связывается с ДНК-связывающим доменом мутантного p53 и ковалентно модифицирует тиоловые группы в центральном коровом ДНК-связывающем домене и, таким образом, реактивирует мутантный p53 [134].

11. Выводы

Поскольку более 50% раковых заболеваний человека несут мутации p53, мутационная инактивация является основным молекулярным механизмом дисфункции p53. Раковые опухоли, несущие мутацию р53, иногда проявляют химиорезистентный фенотип. Хотя внутриклеточный баланс между уровнями экспрессии р53 дикого типа и мутантного р53 может быть критическим детерминантом клеточной судьбы в ответ на повреждение ДНК, мутантный р53 действует как доминантно-негативный ингибитор р53 дикого типа и демонстрирует более длинную половину жизнь, чем p53 дикого типа.Таким образом, необходима разработка новых стратегий для повторной активации мутантного p53, чтобы предоставить ключи к эффективному лечению злокачественных опухолей, несущих мутации p53 .

Благодарности

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в связи с данным исследованием.

Ссылки

1. Elledge S.J. Контрольные точки клеточного цикла: предотвращение кризиса идентичности. Наука. 1996; 274: 1664–1672. [PubMed] [Google Scholar] 2. Сионов Р.В., Хаупт Ю.Клеточный ответ на p53: выбор между жизнью и смертью.Онкоген. 1999; 18: 6145–6157. [PubMed] [Google Scholar] 4. Vousden K.H., Lu X. Live of let die: реакция клетки на p53. Nat. Преподобный Рак. 2002; 2: 594–604. [PubMed] [Google Scholar] 5. Lacroix M., Toillon R.A., Leclercq G. p53 и рак груди, обновленная информация. Endocr. Relat. Рак. 2006. 13: 293–325. [PubMed] [Google Scholar] 6. Куббутат М.Х., Джонс С.Н., Вусден К.Х. Регулирование стабильности p53 с помощью MDM2. Природа. 1997; 387: 299–303. [PubMed] [Google Scholar] 7. Хаупт Ю., Майя Р., Казаз А., Орен М. MDM2 способствует быстрой деградации p53.Природа. 1997; 387: 296–299. [PubMed] [Google Scholar] 8. Хонда Р., Танака Х., Ясуда Х. Онкопротеин MDM2 представляет собой убиквитинлигазу Е3 для опухолевого супрессора р53. FEBS Lett. 1997. 420: 25–27. [PubMed] [Google Scholar] 9. Эль-Дейри В.С. Роль p53 в химиочувствительности и радиочувствительности. Онкоген. 2003; 22: 7486–7495. [PubMed] [Google Scholar] 10. Бейкер С.Дж., Фирон Э.Р., Нигро Дж. М., Гамильтон С. Р., Прайзингер А. Делеции хромосомы 17 и мутации гена p53 при колоректальной карциноме.Наука. 1989; 244: 217–221. [PubMed] [Google Scholar] 11. Нигро Дж. М., Бейкер С. Дж., Прайзингер А. С., Джессап Дж. М., Хостеттер Р., Клири К., Бигнер С. Х., Дэвидсон Н., Бейлин С., Девили П. и др. Мутации в гене p53 встречаются при различных типах опухолей человека. Природа. 1989; 342: 705–708. [PubMed] [Google Scholar] 12. Такахаши Т., Нау М.М., Чиба И., Биррер М.Дж., Розенберг Р.К., Винокур М., Левитт М., Пасс Х., Газдар А.Ф., Минна Д.Д. и др. p53: частая мишень для генетических аномалий при раке легких.Наука. 1989; 246: 491–494. [PubMed] [Google Scholar] 13. Кельман З., Прокоцимер М., Пеллер С., Кан Ю., Речави Г., Манор Ю., Коэн А., Роттер В. Перестройки гена p53 при хроническом миелолейкозе с положительной хромосомой в Филадельфии. Кровь. 1989; 74: 2318–2324. [PubMed] [Google Scholar] 14. Фогельштейн Б. Рак. Смертельное наследство. Природа. 1990; 348: 681–682. [PubMed] [Google Scholar] 15. Холлштейн М.К., Меткалф Р.А., Уэлш Дж.А., Монтесано Р., Харрис К.С. Частая мутация гена p53 при раке пищевода человека.Proc. Natl. Акад. Sci. США. 1990; 87: 9958–9961. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 16. Холлштейн М., Сидранский Д., Фогельштейн Б., Харрис К.С. мутации p53 при раке человека. Наука. 1991; 253: 49–53. [PubMed] [Google Scholar] 17. Воган К., Бернштейн М., Леклерк Дж. М., Бриссон Л., Броссард Дж., Бродер Г. М., Пеллетье Дж., Грос П. Отсутствие мутаций гена p53 в первичных нейробластомах. Cancer Res. 1993; 53: 5269–5273. [PubMed] [Google Scholar] 18. Донехауэр Л.А., Харви М., Слэгл Б.Л., МакАртур М.J., Montgomery C.A., Jr., Butel J.S., Bradley A. Мыши, дефицитные по p53, имеют нормальное развитие, но восприимчивы к спонтанным опухолям. Природа. 1992; 356: 215–221. [PubMed] [Google Scholar] 19. Эль-Дейри В.С., Керн С.Е., Питенпол Дж. А. Определение консенсусного сайта связывания для p53. Nat. Genet. 1992; 1: 45–49. [PubMed] [Google Scholar] 20. Пиетенпол Дж. А., Токино Т., Тиагалингам С., Эль-Дейри В. С., Кинзлер К. В., Фогельштейн Б. Активация транскрипции, специфичная для последовательности, необходима для подавления роста с помощью p53.Proc. Natl. Акад. Sci. США. 1994; 91: 1998–2002. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 21. Херсковиц I. Функциональная инактивация генов доминантно-негативными мутациями. Природа. 1987. 329: 219–222. [PubMed] [Google Scholar] 22. Херсковиц I. Регуляторная иерархия клеточной специализации дрожжей. Природа. 1989; 342: 749–757. [PubMed] [Google Scholar] 23. Кроуфорд Л.В., Пим Д.С., Лэмб П. Клеточный белок р53 в опухолях человека. Мол. Биол. Med. 1984; 2: 261–272. [PubMed] [Google Scholar] 24. Катторетти Г., Рильке Ф., Андреола С., Д’Амато Л., Делия Д. Экспрессия P53 при раке груди. Int. J. Рак. 1986; 41: 178–183. [PubMed] [Google Scholar] 25. Чен П.Л., Чен Ю.М., Букштейн Р., Ли В.Х. Генетические механизмы подавления опухоли геном р53 человека. Наука. 1990; 250: 1576–80. [PubMed] [Google Scholar] 26. Фогельштейн Б., Кинцлер К. функция и дисфункция р53. Клетка. 1992; 70: 523–526. [PubMed] [Google Scholar] 27. Велкулеску В.Е., Эль-Дейри В.С. Биологическое и клиническое значение гена-супрессора опухоли p53.Clin. Chem. 1996. 42: 858–868. [PubMed] [Google Scholar] 28. Фогельштейн Б., Лейн Д., Левин А.Дж. Серфинг в сети p53. Природа. 2000. 408: 307–310. [PubMed] [Google Scholar] 29. Чжу Дж., Чжоу В., Цзян Дж., Чен X. Идентификация нового функционального домена р53, который необходим для опосредования апоптоза. J. Biol. Chem. 1998. 273: 13030–13036. [PubMed] [Google Scholar] 30. Venot C., Maratrat M., Sierra V., Conseiller E., Debussche L. Определение мутанта с дефицитом функции трансактивации p53 и характеристика двух независимых субдоменов трансактивации p53.Онкоген. 1999; 18: 2405–2410. [PubMed] [Google Scholar] 31. Фаббро М., Хендерсон Б. Регулирование опухолевых супрессоров путем ядерно-цитоплазматического перемещения. Exp. Клетка. Res. 2003. 282: 59–69. [PubMed] [Google Scholar] 32. Ким И.С., Ким Д.Х., Хан С.М., Чин М.Ю., Нам Х.Дж., Чо Х.П., Чой С.Ю., Сон Б.Дж., Ким Е.Р., Бэ Ю.С., Мун Ю. Усеченная форма импортина альфа, идентифицированная в клетках рака молочной железы, ингибирует ядерный импорт p53. J. Biol. Chem. 2000; 275: 23139–23145. [PubMed] [Google Scholar] 33. Кау Т.Р., Шредер Ф., Ramaswamy S., Wojciechowski C.L., Zhao J.J., Roberts T.M., Clardy J., Sellers W.R., Silver P.A. Химический генетический скрининг выявляет ингибиторы регулируемого ядерного экспорта фактора транскрипции Forkhead в опухолевых клетках с дефицитом PTEN. Раковая клетка. 2003. 4: 463–476. [PubMed] [Google Scholar] 34. Стоммель Дж. М., Марченко Н. Д., Хименес Г. С., Молл Ю. М., Хоуп Т. Дж., Валь Г. М. Обогащенный лейцином сигнал ядерного экспорта в домене тетрамеризации p53: регуляция субклеточной локализации и активности p53 путем маскировки NES.EMBO J. 1999; 18: 1660–1672. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 35. Брукс С.Л., Ли М., Гу В. Механистические исследования MDM2-опосредованного убиквитинирования в регуляции p53. J. Biol. Chem. 2007; 282: 22804–22815. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 36. Уокер К.К., Левин А.Дж. Идентификация нового функционального домена p53, необходимого для эффективного подавления роста. Proc. Natl. Акад. Sci. США. 1996; 93: 15335–15340. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 37. Батист Н., Фридлендер П., Chen X., Prives C. Богатый пролином домен р53 необходим для взаимодействия с противоопухолевыми агентами, способствующими апоптозу опухолевых клеток. Онкоген. 2002; 21: 9–21. [PubMed] [Google Scholar] 38. Joerger A.C., Fersht A.R. Спасение структуры-функции: разнообразная природа распространенных мутантов рака p53. Онкоген. 2007; 26: 2226–2242. [PubMed] [Google Scholar] 39. Чин К.В., Уэда К., Пастан И. Модуляция активности промотора гена MDR1 человека с помощью Ras и p53. Наука. 1992; 255: 459–462. [PubMed] [Google Scholar] 40.Кэдвелл К., Замбетти Г.П. Эффекты опухолевой супрессорной активности р53 дикого типа и усиление функции мутантного р53 на рост клеток. Ген. 2001; 277: 15–30. [PubMed] [Google Scholar] 41. Деб С., Джексон С.Т., Саблер М.Л., Мартин Д.У. Модуляция клеточных и вирусных промоторов мутантными белками p53 человека, обнаруженными в опухолевых клетках. J. Virol. 1992; 66: 6164–6170. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 42. Диттмер Д., Пати С., Замбетти Г., Чу С., Терески А.К., Мур М., Финли К., Левин А.Дж. Усиление функциональных мутаций в p53.Nat. Genet. 1993; 4: 42–46. [PubMed] [Google Scholar] 43. Лудес-Мейерс Дж. Х., Саблер М. А., Шивакумар С. В., Муньос Р. М., Цзян П., Биггер Дж. Э., Браун Д. Р., Деб С. П., Деб С. Активация транскрипции промотора рецептора эпидермального фактора роста человека р53 человека. Мол. Клетка. Биол. 1996. 16: 6009–6019. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 44. Frazier M.W., He X., Wang J., Gu Z., Cleveland J.L., Zambetti G.P. Активация экспрессии гена c-myc мутантами p53 опухолевого происхождения требует наличия дискретного С-концевого домена.Мол. Клетка. Биол. 1998. 18: 3735–3743. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 45. Lanyi A., Deb D., Seymour R.C., Ludes-Meyers J.H., Subler M.A., Deb S. Фенотип увеличения функции опухолевого мутантного p53 требует наличия домена связывания нуклеиновой кислоты, специфичного для олигомеризации / неспецифической последовательности. Онкоген. 1998. 16: 3169–3176. [PubMed] [Google Scholar] 46. Scian M.J., Stagliano K.E., Deb D., Ellis M.A., Carchman E.H., Das A., Valerie K., Deb S.P., Deb S. Мутанты р53, полученные из опухоли, индуцируют онкогенез путем трансактивации генов, способствующих росту.Онкоген. 2004. 23: 4430–4443. [PubMed] [Google Scholar] 47. Ломакс М.Э., Барнс Д.М., Гилкрист Р., Пиксли С.М., Варли Дж.М., Кэмплджон Р.С. Два функциональных анализа, используемых для обнаружения необычной мутации в домене олигомеризации р53 в семействе, подобном Li-Fraumeni. Онкоген. 1997; 14: 1869–1874. [PubMed] [Google Scholar] 48. Ломакс М.Э., Барнс Д.М., Хапп Т.Р., Пиксли С.М., Кэмплджон Р.С. Характеристика мутаций домена олигомеризации p53, выделенных из Li-Fraumeni и Li-Fraumeni подобных членов семейства.Онкоген. 1998. 17: 643–649. [PubMed] [Google Scholar] 49. ДиДжиаммарино Е.Л., Ли А.С., Кэдвелл К., Чжан В., Ботнер Б., Рибейро Р.С., Замбетти Г., Кривацки Р.В. Новый механизм онкогенеза, включающий pH-зависимую дестабилизацию мутантного тетрамера p53. Nat. Struct. Биол. 2002; 9: 12–16. [PubMed] [Google Scholar] 50. Накамура Ю., Одзаки Т., Ниизума Х., Охира М., Камиджо Т., Накагавара А. Функциональная характеристика нового мутанта р53, полученного путем гомозиготной делеции в клеточной линии нейробластомы.Biochem. Биофиз. Res. Commun. 2007; 354: 892–898. [PubMed] [Google Scholar] 51. Кэхилли-Снайдер Л., Ян-фэн Т., Франк У., Джордж Д.Л. Молекулярный анализ и хромосомное картирование амплифицированных генов, выделенных из трансформированной линии клеток 3Т3 мыши. Сомат. Cell Mol. Genet. 1987. 13: 235–244. [PubMed] [Google Scholar] 52. Фахарзаде С.С., Труско С.П., Георгий Д.Л. Онкогенный потенциал связан с повышенной экспрессией гена, который амплифицируется в линии опухолевых клеток мыши. EMBO J. 1991; 10: 1565–1569. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 53.Родригес М.С., Дестерро Дж. М., Лейн С., Лейн Д.П., Хэй Р.Т. Множественные С-концевые остатки лизина нацелены на p53 для опосредованной убиквитин-протеасомой деградации. Мол. Клетка. Биол. 2000; 20: 8458–8467. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 54. Лай З., Ферри К.В., Даймонд М.А., Ви К.Э., Ким Й.Б., Ма Дж., Ян Т., Бенфилд П.А., Коупленд Р.А., Аугер К.Р. Mdm2 человека опосредует множественное моноубиквитинирование р53 с помощью механизма, требующего изомеризации ферментов. J. Biol. Chem. 2001; 276: 31357–31367. [PubMed] [Google Scholar] 55.Маки К.Г., Хьюбрегтсе Дж. М., Хоули П. М. Убиквитинирование in vivo и опосредованная протеасомами деградация p53 (1) Cancer Res. 1996; 56: 2649–2654. [PubMed] [Google Scholar] 56. Kulikov R., Letienne J., Kaur M., Grossman S.R., Arts J., Blattner C.Mdm2 облегчает ассоциацию p53 с протеасомой. Proc. Natl. Акад. Sci. США. 2010; 107: 10038–10043. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 57. Гроссман С.Р., Деато М.Э., Бриньоне К., Чан Х.М., Кунг А.Л., Тагами Х., Накатани Ю., Ливингстон Д.М. Полиубиквитинирование р53 за счет активности убиквитинлигазы р300.Наука. 2003; 300: 342–344. [PubMed] [Google Scholar] 58. Ши Д., Поп М.С., Куликов Р., Лав И.М., Кунг А.Л., Гроссман С.Р. CBP и p300 представляют собой цитоплазматические полиубиквитинлигазы E4 для p53. Proc. Natl. Акад. Sci. США. 2009; 106: 16275–16280. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 59. Ленг Р.П., Лин Ю., Ма У., Ву Х., Леммерс Б., Чанг С., Парант Дж. М., Лозано Г., Хакем Р., Бенхимол С. Pirh3, индуцированная р53 убиквитин-протеиновая лигаза, способствует развитию р53 деградация. Клетка. 2003; 112: 779–791. [PubMed] [Google Scholar] 60.Дорнан Д., Вертц И., Шимицу Х., Арнотт Д., Франц Г.Д., Дауд П., О’Рурк К., Кеппен Х., Диксит В. Убиквитинлигаза COP1 является критическим негативным регулятором р53. Природа. 2004; 429: 86–92. [PubMed] [Google Scholar] 61. Дорнан Д., Бхедда С., Ньютон К., Инс В., Франц Г.Д., Дауд П., Кеппен Х., Диксит В.М., Френч Д.М. COP1, негативный регулятор p53, сверхэкспрессируется в аденокарциномах груди и яичников. Cancer Res. 2004. 64: 7226–7230. [PubMed] [Google Scholar] 62. Ли М., Чен Д., Шайло А., Луо Дж., Николаев А.Ю., Цинь Дж., Гу В. Деубиквитинирование p53 с помощью HAUSP является важным путем стабилизации p53. Природа. 2002; 416: 648–653. [PubMed] [Google Scholar] 63. Moll U.M., LaQuaglia M., Benard J., Riou G. Белок p53 дикого типа подвергается цитоплазматической секвестрации в недифференцированных нейробластомах, но не в дифференцированных опухолях. Proc. Natl. Акад. Sci. США. 1995; 92: 4407–4411. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 64. Остермейер А.Г., Рунко Э., Винкфилд Б. Цитоплазматически секвестрированный белок р53 дикого типа в нейробластоме перемещается в ядро ​​с помощью С-концевого пептида.Proc. Natl. Акад. Sci. США. 1996; 93: 15190–15194. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 65. Ямамото Х., Одзаки Т., Наканиши М., Кикучи Х., Йошида К., Хори Х., Кувано Х., Накагавара А. Окислительный стресс индуцирует p53-зависимый апоптоз в клетке гепатобластомы через ее ядерную транслокацию. Гены Клетки. 2007; 12: 461–471. [PubMed] [Google Scholar] 66. Беккер К., Марченко Н.Д., Морис М., Молл У.М. Гиперубиквитилирование р53 дикого типа способствует секвестрации цитоплазмы в нейробластоме.Смерть клетки. Отличаются. 2007. 14: 1350–1360. [PubMed] [Google Scholar] 67. Николаев А.Ю., Ли М., Пушкаш Н., Цзюнь Цинь Дж., Гу В. Парк: цитоплазматический якорь для p53. Клетка. 2003; 112: 29-40. [PubMed] [Google Scholar] 68. Михара М., Эрстер С., Заика А., Петренко О., Читтенден Т., Панкоска П., Молл У.М. p53 играет прямую апоптогенную роль в митохондриях. Мол. Клетка. 2003; 11: 577–590. [PubMed] [Google Scholar] 69. Марченко Н.Д., Вольф С., Эрстер С., Беккер К., Молл У.М. Моноубиквитилирование способствует транслокации митохондриального p53.EMBO J. 2007; 26: 923–934. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 70. Беккер К., Марченко Н.Д., Паласиос Г., Молл У.М. Роль HAUSP в подавлении опухоли на модели ксенотрансплантата карциномы толстой кишки человека. Клеточный цикл. 2008. 7: 1205–1213. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 71. Эль-Дейри В.С., Токино Т., Велкулеску В.Э., Леви Д. Б., Парсонс Р., Трент Дж. М., Лин Д., Мерсер В. Е., Кинзлер К. В., Фогельштейн Б. WAF1, потенциальный медиатор подавления опухоли p53. Клетка. 1993; 75: 817–825. [PubMed] [Google Scholar] 72.Харпер Дж. У., Адами Г. Р., Вэй Н., Кейомарси К., Элледж С. Дж. Белок Cip1, взаимодействующий с p21 Cdk, является мощным ингибитором циклинзависимых киназ G1. Клетка. 1993; 75: 805–816. [PubMed] [Google Scholar] 73. Xiong Y., Hannon G.J., Zhang H., Casso D., Kobayashi R., Beach D. p21 – универсальный ингибитор циклинкиназ. Природа. 1993; 366: 701–704. [PubMed] [Google Scholar] 74. Нода А., Нинг Ю., Венейбл С.Ф., Перейра-Смит О.М., Смит Дж.Р. Клонирование ингибиторов синтеза ДНК, полученных из стареющих клеток, с использованием скрининга экспрессии.Exp. Cell Res. 1994; 211: 90–98. [PubMed] [Google Scholar] 75. Хермекинг Х., Ленгауэр С., Поляк К., Хе Т.С., Чжан Л., Тиагалингам С., Кинзлер К.В., Фогельштейн Б. 14-3-3 сигма представляет собой регулируемый p53 ингибитор прогрессирования G2 / M. Мол. Клетка. 1997; 1: 3–11. [PubMed] [Google Scholar] 76. Ян Х.Ю., Вэнь Ю.Ю., Чен С.Х., Лозано Г., Ли М.Х. 14-3-3 сигма положительно регулирует р53 и подавляет рост опухоли. Мол. Клетка. Биол. 2003. 23: 7096–7107. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 77. Оки Р., Немото Дж., Мурасава Х., Oda E., Inazawa J., Tanaka N., Taniguchi T. Reprimo, новый кандидат в медиатор остановки клеточного цикла, опосредованной p53, в фазе G2. J. Biol. Chem. 2000; 275: 22627–22630. [PubMed] [Google Scholar] 78. Танака Х., Аракава Х., Ямагути Т., Сираиси К., Фукуда С., Мацуи К., Такей Ю., Накамура Ю. Ген рибонуклеотидредуктазы, участвующий в p53-зависимой контрольной точке клеточного цикла для повреждения ДНК. Природа. 2000; 404: 42–49. [PubMed] [Google Scholar] 80. Сельвакумаран М., Лин Х.К., Мияшита Т., Ван Х.Г., Краевски С., Reed J.C., Hoffman B., Liebermann D. Немедленное раннее повышение экспрессии bax с помощью p53, но не TGF beta 1: парадигма для различных путей апоптоза. Онкоген. 1994; 9: 1791–1798. [PubMed] [Google Scholar] 82. Ода К., Аракава Х., Танака Т., Мацуда К., Таникава К., Мори Т., Нисимори Х., Тамай К., Токино Т., Накамура Ю., Тая Ю. p53AIP1, потенциальный медиатор p53 – зависимый апоптоз и его регуляция с помощью Ser-46-фосфорилированного p53. Клетка. 2000. 102: 849–862. [PubMed] [Google Scholar] 83. Мацуда К., Yoshida K., Taya Y., Nakamura K., Nakamura Y., Arakawa H. p53AIP1 регулирует митохондриальный апоптотический путь. Cancer Res. 2002; 62: 2883–2889. [PubMed] [Google Scholar] 84. Ода Э., Оки Р., Мурасава Х., Немото Дж., Шибуэ Т., Ямасита Т., Токино Т., Танигучи Т., Танака Н. Нокса, член семьи Bh4-2 и кандидат только на Bh4 медиатор р53-индуцированного апоптоза. Наука. 2000; 288: 1053–1058. [PubMed] [Google Scholar] 85. Со Ю. В., Шин Дж. Н., Ко К. Х., Ча Дж. Х., Пак Дж. Ю., Ли Б. Р., Юн С. В., Ким Ю.М., Соль Д.В., Ким Д.В., Инь X.M., Ким Т.Х. Молекулярный механизм индуцированной Noxa митохондриальной дисфункции при гибели клеток, опосредованной р53. J. Biol. Chem. 2003; 278: 48292–48199. [PubMed] [Google Scholar] 86. Yu J., Zhang L., Hwang P.M., Kinzler K.W., Vogelstein B.PUMA индуцирует быстрый апоптоз клеток колоректального рака. Мол. Клетка. 2001; 7: 673–682. [PubMed] [Google Scholar] 87. Накано К., Вусден К.Х. PUMA, новый проапоптотический ген, индуцируется p53. Мол. Клетка. 2001. 7: 683–694. [PubMed] [Google Scholar] 88.Jeffers J.R. Puma является важным медиатором p53-зависимых и независимых путей апоптоза. Раковая клетка. 2003. 4: 321–328. [PubMed] [Google Scholar] 89. Пьетт Дж., Нил Х., Марешал В. Mdm2: сохранение p53 под контролем. Онкоген. 1997; 15: 1001–1010. [PubMed] [Google Scholar] 90. Haneda M., Kojima E., Nishikimi A., Hasegawa T., Nakashima I., Isobe K. Протеиновая фосфатаза 1, но не протеинфосфатаза 2A, дефосфорилирует ДНК-повреждающий стресс-индуцированный фосфосерин 15 из p53. FEBS Lett. 2004; 567: 171–174.[PubMed] [Google Scholar] 91. Li H.H., Cai X., Shouse G.P., Piluso L.G., Liu X. Специфическая регуляторная субъединица PP2A, B56gamma, опосредует дефосфорилирование p53, вызванное повреждением ДНК, по Thr55. EMBO J. 2007; 26: 402–411. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 92. Ханна К.К., Китинг К.Э., Козлов С., Скотт С., Гатей М., Хобсон К., Тая Ю., Габриэлли Б., Чан Д., Лиз-Миллер С.П., Лавин М.Ф. ATM связывает и фосфорилирует p53: Картирование области взаимодействия. Nat. Genet. 1998. 20: 398–400. [PubMed] [Google Scholar] 93.Тиббетс Р.С., Брамбо К.М., Уильямс Дж. М., Саркария Дж. Н., Клиби В.А., Шие С.Ю., Тайя Ю., Привес К., Абрахам Р.Т. Роль ATR в фосфорилировании р53, вызванном повреждением ДНК. Genes Dev. 1999. 13: 152–157. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 94. Goudelock D.M., Jiang K., Pereira E., Russell B., Sanchez Y. Регуляторные взаимодействия между киназой контрольной точки Chk1 и белками ДНК-зависимого протеинкиназного комплекса. J. Biol. Chem. 2003; 278: 29940–29947. [PubMed] [Google Scholar] 95.Shieh S.Y., Taya Y., Prives C. Индуцируемое повреждением ДНК фосфорилирование p53 по N-концевым сайтам, включая новый сайт Ser20, требует тетрамеризации. EMBO J. 1999; 18: 1815–1823. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 96. Крейг А., Скотт М., Берч Л., Смит Г., Болл К., Хапп Т. Аллостерические эффекты опосредуют фосфорилирование CHK2 домена трансактивации p53. EMBO Rep. 2003; 4: 787–792. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 97. Се С., Ван К., Ву Х., Когсуэлл Дж., Лу Л., Джанвар-Униял М., Dai W. Индуцированное активными формами кислорода фосфорилирование р53 на серине 20 частично опосредуется поло-подобной киназой-3. J. Biol. Chem. 2001; 276: 36194–36199. [PubMed] [Google Scholar] 98. Д’Орази Г., Чеккинелли Б., Бруно Т., Манни И., Хигашимото Ю., Сайто С., Гостисса М., Коэн С., Маркетти А., Дель Сал Г., Пьяджио Г., Фанчулли М. , Appella E., Soddu S. Гомеодомен-взаимодействующая протеинкиназа-2 фосфорилирует p53 по Ser 46 и опосредует апоптоз. Nat. Cell Biol. 2002; 4: 11–19. [PubMed] [Google Scholar] 99.Йошида К., Лю Х., Мики Ю. Дельта протеинкиназы C регулирует фосфорилирование Ser46 опухолевого супрессора p53 в апоптотическом ответе на повреждение ДНК. J. Biol. Chem. 2006; 281: 5734–40. [PubMed] [Google Scholar] 100. Herrmann C.P., Kraiss S., Montenarh M. Ассоциация казеинкиназы II с иммуноочищенным p53. Онкоген. 1991; 6: 877–884. [PubMed] [Google Scholar] 101. Delphin C., Huang KP, Scotto C., Chapel A., Vincon M., Chambaz E., Garin J., Baudier J. Фосфорилирование p53 кальций-зависимой протеинкиназой C in vitro – характеристика протеин- сайт связывания киназы-C на р53.Евро. J. Biochem. 1997. 245: 684–692. [PubMed] [Google Scholar] 102. Хапп Т.Р., Мик Д.В., Мидгли К.А., Лейн Д.П. Регулирование специфической функции связывания ДНК р53. Клетка. 1992; 71: 875–886. [PubMed] [Google Scholar] 103. Друг С. p53: Взгляд на марионетку за игрой теней. Наука. 1994; 265: 334–335. [PubMed] [Google Scholar] 104. Ando K., Ohira M., Ozaki T., Nakagawa A., Akazawa K., Suenaga Y., Nakamura Y., Koda T., Kamijo T., Murakami Y., Nakagawara A. Polo-like kinase 1 (Plk1 ) подавляет функцию p53 за счет физического взаимодействия и фосфорилирования.J. Biol. Chem. 2004; 279: 25549–25561. [PubMed] [Google Scholar] 105. Shikama N., Lee C.W., France S., Delavaine L., Lyon J., Krstic-Demonacos M., La Thangue N.B. Новый кофактор p300, регулирующий ответ p53. Мол. Клетка. 1999; 4: 365–376. [PubMed] [Google Scholar] 106. Сакагучи К., Эррера Дж. Э., Сайто С., Мики Т., Бустин М., Василев А., Андерсон К. В., Аппелла Е. Повреждение ДНК активирует р53 через каскад фосфорилирования-ацетилирования. Genes Dev. 1998; 12: 2831–2841. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 107.Юань З.М., Хуан Ю., Исико Т., Накада С., Уцугисава Т., Шиоя Х., Уцугисава Ю., Йокояма К., Вейксельбаум Р., Ши Ю., Куфе Д. Роль p300 в стабилизации p53 в ответ на повреждение ДНК. J. Biol. Chem. 1999; 274: 1883–1886. [PubMed] [Google Scholar] 108. Мичишита Э., Парк Дж. Ю., Бурнескис Дж. М., Барретт Дж. К., Хорикава И. Эволюционно консервативные и неконсервативные клеточные локализации и функции белков SIRT человека. Мол. Биол. Клетка. 2005; 16: 4623–4635. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 109.Каваи Х., Не Л., Видершейн Д., Юань З.М. Двойная роль p300 в регуляции стабильности p53. J. Biol. Chem. 2001; 276: 45928–45932. [PubMed] [Google Scholar] 110. Ferguson AT, Evron E., Umbricht CB, Pandita TK, Chan TA, Hermeking H., Marks JR, Lambers AR, Futreal PA, Stampfer MR, Sukumar S. Высокая частота гиперметилирования в локусе сигмы 14-3-3 приводит к подавление гена при раке груди. Proc. Natl. Акад. Sci. США. 2000; 97: 6049–6054. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 111.Судзуки Х., Ито Ф., Тойота М., Кикучи Т., Какиучи Х., Имаи К. Инактивация сигма-гена 14-3-3 связана с гиперметилированием 5′-островков CpG при раке человека. Cancer Res. 2000. 60: 4353–4357. [PubMed] [Google Scholar] 112. Ивата Н., Ямамото Х., Сасаки С., Ито Ф., Судзуки Х., Кикучи Т., Кането Х., Ику С., Озеки И., Карино Ю., Сато Т., Тойота Дж., Сато М. ., Эндо Т., Имаи К. Частое гиперметилирование CpG-островков и потеря экспрессии сигма-гена 14-3-3 в гепатоцеллюлярной карциноме человека.Онкоген. 2000. 19: 5298–5302. [PubMed] [Google Scholar] 113. Самуэльс-Лев Ю., О’Коннор Д. Д., Бергамаски Д., Триджанте Г., Се Дж. К., Чжун С., Кампарге И., Наумовски Л., Крук Т., Лу X. Белки ASPP специфически стимулируют апоптотическую функцию p53. . Мол. Клетка. 2001; 8: 781–794. [PubMed] [Google Scholar] 114. Ивабучи К., Бартель П.Л., Ли Б., Марраччино Р., Филдс С. Два клеточных белка, которые связываются с р53 дикого типа, но не с мутантным. Proc. Natl. Акад. Sci. США. 1994; 91: 6098–6102. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 115.Ивабучи К., Ли Б., Масса Х. Ф., Траск Б. Дж., Дэйт Т., Филдс С. Стимуляция р53-опосредованной активации транскрипции с помощью р53-связывающих белков, 53BP1 и 53BP2. J. Biol. Chem. 1998. 273: 26061–26061. [PubMed] [Google Scholar] 116. Rappold I., Iwabuchi K., Date T., Chen J. Опухолевый супрессор p53-связывающий белок 1 (53BP1) участвует в сигнальных путях повреждения ДНК. J. Cell Biol. 2001. 153: 613–620. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 117. Одзаки Т., Нагасе Т., Ичимия С., Секи Н., Охири М., Номура Н., Такада Н., Сакияма С., Вебер Б.Л., Накагавара А. NFBD1 / KIAA0170 – это новый ядерный транскрипционный трансактиватор с доменом BRCT. ДНК Cell Biol. 2000. 19: 475–485. [PubMed] [Google Scholar] 118. Стюарт Г.С., Ван Б., Бигнелл С.Р., Тейлор А.М., Элледж С.Дж. MDC1 является медиатором контрольной точки повреждения ДНК млекопитающих. Природа. 2003; 421: 961–966. [PubMed] [Google Scholar] 119. Голдберг М., Штуки М., Фальк Дж., Д’Амур Д., Рахман Д., Паппин Д., Бартек Дж., Джексон С. П. MDC1 требуется для проверки внутри-S-фазного повреждения ДНК.Природа. 2003; 421: 952–956. [PubMed] [Google Scholar] 120. Lou Z., Minter-Dykhouse K., Wu X., Chen J. MDC1 связан с активированным CHK2 в путях ответа на повреждение ДНК млекопитающих. Природа. 2003; 421: 957–961. [PubMed] [Google Scholar] 121. Lou Z., Minter-Dykhouse K., Franco S., Gostissa M., Rivera MA, Celeste A., Manis JP, van Deursen J., Nussenzweig A., Paull TT, Alt FW, Chen J. MDC1 поддерживает геномную стабильность участвуя в амплификации ATM-зависимых сигналов повреждения ДНК. Мол. Клетка.2006; 21: 187–200. [PubMed] [Google Scholar] 122. Nakanishi M., Ozaki T., Yamamoto H., Hanamoto T., Kikuchi H., Furuya K., Asaka M., Delia D., Nakagawara A. NFBD1 / MDC1 связывается с p53 и регулирует его функцию на перекрестке между клетками. выживание и смерть в ответ на повреждение ДНК. J. Biol. Chem. 2007. 282: 22993–23004. [PubMed] [Google Scholar] 123. Ито Ю. Гены RUNX в развитии и раке: регуляция экспрессии вирусных генов и открытие генов семейства RUNX. Adv. Cancer Res. 2008; 99: 33–76.[PubMed] [Google Scholar] 124. Ли К.Л., Ито К., Сакакура К., Фукамачи Х., Иноуэ К., Чи Х.З., Ли К.Ю., Номура С., Ли К.В., Хан С.Б. и др. Причинно-следственная связь между потерей экспрессии RUNX3 и раком желудка. Клетка. 2002; 109: 113–124. [PubMed] [Google Scholar] 125. Yamada C., Ozaki T., Ando K., Suenaga Y., Inoue K., Ito Y., Okoshi R., Kageyama H., Kimura H., Miyazaki M., Nakagawara A. RUNX3 модулирует фосфорилирование, опосредованное повреждением ДНК. супрессора опухолей p53 на Ser-15 и действует как коактиватор для p53.J. Biol. Chem. 2010; 285: 16693–16703. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 126. Yin Y., Stephen C.W., Luciani M.G., Fahraeus R. Стабильность и активность p53 регулируются Mdm2-опосредованной индукцией альтернативных продуктов трансляции p53. Nat. Cell Biol. 2002; 4: 462–467. [PubMed] [Google Scholar] 127. Бурдон Дж. К., Фернандес К., Мюррей-Змиевски Ф., Лю Г., Диот А., Ксиродимас Д. П., Сэвилл М. К., Лейн Д. П. Изоформы р53 могут регулировать транскрипционную активность р53. Genes Dev. 2005; 19: 2122–2137. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 129.Фишер Д. Апоптоз в терапии рака: переходя порог. Клетка. 1994; 78: 539–542. [PubMed] [Google Scholar] 130. Василев Л.Т., Ву Б.Т., Грейвс Б., Карвахал Д., Подласки Ф., Филипович З., Конг Н., Каммлотт У., Лукач К., Кляйн К., Фотухи Н., Лю Э.А. Активация in vivo пути p53 низкомолекулярными антагонистами MDM2. Наука. 2004. 303: 844–848. [PubMed] [Google Scholar] 131. Азми А.С., Филип П.А., Бек Ф.В., Ван З., Банерджи С., Ван С., Ян Д., Саркар Ф.Х., Мохаммад Р.М. Комбинация MI-219-цинк: новая парадигма в терапии на основе ингибиторов MDM2.Онкоген. 2011; 30: 117–126. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 132. Витали Р., Чези В., Танно Б., Феррари-Аморотти Г., Доминичи С., Калабретта Б., Рашелла Г. Активация p53-зависимых ответов в опухолевых клетках, обработанных взаимодействующим с PARC пептидом. Biochem. Биофиз. Res. Commun. 2008. 368: 350–356. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 133. Быков В.Ю., Исаева Н., Шилов А., Хульткранц М., Пугачева Е., Чумаков П., Бергман Дж., Виман К.Г., Селиванова Г. Восстановление функции опухолевого супрессора мутантному р53 с помощью низкомолекулярного соединения .Nat. Med. 2002. 8: 282–288. [PubMed] [Google Scholar] 134. Ламберт Дж. М., Горзов П., Вепринцев Д. Б., Содерквист М., Сегельбак Д., Бергман Дж., Фершт А. Р., Эно П., Виман К. Г., Быков В. Ю. PRIMA-1 реактивирует мутантный p53 за счет ковалентного связывания с коровым доменом. Раковая клетка. 2009. 15: 376–388. [PubMed] [Google Scholar]

Потеря поликистинов подавляет децилирование через активацию пути целостности центросомы

Life Sci Alliance. 2020 сен; 3 (9): e202000750.

Департамент клеточной биологии, Центр медицинских наук Университета Оклахомы, Оклахома-Сити, Оклахома, США

Поступила в редакцию 21 апреля 2020 г .; Пересмотрено 1 июля 2020 г .; Принята в печать 3 июля 2020 г.

Эта статья цитируется в других статьях в PMC.

Abstract

Первичная ресничка представляет собой основанную на микротрубочках, антенно-подобную органеллу, содержащую несколько сигнальных путей. Он следует циклическому паттерну сборки и децилиляции (разборки и / или сброса), когда клетки выходят и снова входят в клеточный цикл, соответственно. Как правило, потеря первичных ресничек приводит к цистогенезу почек. Однако на животных моделях аутосомно-доминантной поликистозной болезни почек, основного заболевания, вызванного мутациями в генах полицистина ( Pkd1 или Pkd2 ), абляция первичных ресничек или ускорение децилирования подавляет рост кисты, тогда как замедление дециляции усиливается цистогенез.Здесь мы показываем, что децилиция задерживается в кистозном эпителии мышиной модели постнатальной делеции Pkd1 и в Pkd1 – или Pkd2 – нулевых клетках в культуре. Механистические эксперименты показывают, что истощение PKD1 активирует путь центросомной целостности / митотического наблюдения с участием 53BP1, USP28 и p53, что приводит к задержке децилирования. Снижение скорости децилитации вызывает длительную активацию сигнальных путей на основе ресничек, которые могут способствовать росту кисты.Наше исследование связывает поликистины с динамикой ресничек, идентифицирует клеточную децилизацию ниже пути центросомной целостности и помогает объяснить прокистозные эффекты первичных ресничек при аутосомно-доминантной поликистозной болезни почек.

Введение

Первичная ресничка представляет собой одиночную антенно-подобную органеллу, присутствующую практически во всех типах клеток человеческого тела. Он состоит из аксонемы, микротрубочковой структуры, покрытой специальной формой плазматической мембраны и базального тельца, модифицированной центросомы, формирующей основу реснички (Haimo & Rosenbaum, 1981).Сборка и поддержание ресничек достигается за счет внутрижгутикового транспорта (IFT), опосредованного согласованным действием антероградных кинезинов (комплекс IFT-B) и ретроградного динеина (комплекс IFT-A) (Ishikawa & Marshall, 2011; Kobayashi & Dynlacht, 2011; Nigg & Stearns, 2011; Sung & Leroux, 2013). Реснички достигают своей максимальной длины в состоянии покоя (G0) и постепенно разбираются или сбрасываются при повторном входе в клеточный цикл (Pugacheva et al, 2007; Liu et al, 2018; Mirvis et al, 2018, 2019; Wang & Dynlacht, 2018).Постепенная разборка и отторжение ресничек – сложный процесс, и хотя он был связан с развитием клеточного цикла в культивируемых клетках, его биологическая роль в контексте всего животного неясна (Sanchez & Dynlacht, 2016; Breslow & Holland, 2019). Ускоренная или пониженная скорость разборки ресничек может уменьшать или увеличивать время, которое клетки проводят в G1 и, таким образом, усиливать или замедлять повторный вход клеточного цикла, соответственно (Kim et al, 2011; Li et al, 2011; Phua et al, 2017). Также появляются доказательства связи ресничек и реакции на повреждение ДНК (Chaki et al, 2012; Johnson & Collis, 2016; Walz, 2017).Следовательно, также возможно, что пониженная скорость разборки может также запускать активацию ответа на повреждение ДНК, вызывая остановку клеток в G2 и G1 для полной резорбции ресничек. В этом случае несвоевременная разборка ресничек может привести к анеуплоидии и геномной нестабильности, что может привести к неконтролируемой пролиферации. Следовательно, изменения в скорости разборки и / или шедирования ресничек могут иметь положительные и отрицательные эффекты на прогрессию клеточного цикла в зависимости от клеточного контекста и типа и передачи сигналов на основе ресничек.

HEF1 / AURKA / HDAC6 (Pugacheva et al, 2007), Nek2 / Kif24 (Kim et al, 2015) и Plk1 / Kif2A (Miyamoto et al, 2015) являются основными путями разборки ресничек, которые активируются при индуцировании клеток. повторно войти в клеточный цикл. В пути HEF1 / AURKA / HDAC6 HEF1 является каркасным белком, который при связывании с AURKA индуцирует аутофосфорилирование и активацию AURKA (Nikonova et al, 2013). Активированный AURKA фосфорилирует HEF1 и HDAC6 (Никонова и др., 2013). Активированный HDAC6 ведет к разборке ресничек за счет деацетилирования α-тубулина, вызывая деполимеризацию микротрубочек (Pugacheva et al, 2007).Этот путь молчит в G1 / G0 и не участвует в контроле длины ресничек в G1 / G0, но активируется за счет активации HEF1 в ответ на передачу митогенных сигналов (Pugacheva et al, 2007). AURKA и некоторые др. Центросомные белки, включая NDE1, негативный регулятор цилиогенеза, образуют большой комплекс, называемый комплексом разборки ресничек (CDC) (Gabriel et al, 2016). Активность CDC может быть положительно или отрицательно модулирована несколькими факторами / путями. Эти пути включают передачу сигналов Ca ²⁺ (Plotnikova et al, 2010, 2012), неканоническую передачу сигналов Wnt5a (Lee et al, 2012), изменения в составе фосфолипидов цилиарной мембраны (Bielas et al, 2009; Phua et al, 2017) и др.Супрессоры опухолей, такие как Von Hippel-Lindau (pVHL) (Xu et al, 2010) и гомолог фосфатазы и тензина (PTEN) (Shnitsar et al, 2015), негативно регулируют разборку ресничек. Таким образом, разборка ресничек в значительной степени контролируется тремя путями, на которые в дальнейшем могут влиять внеклеточные / средовые и внутриклеточные факторы.

ADPKD характеризуется образованием массивных кист в почках и повышенной пролиферацией клеток (Bhunia et al, 2002; Kim et al, 2004; Zhou, 2009).В культуре клеток потеря Pkd1 или Pkd2 , по-видимому, ускоряет переход G1 в S, влияя на уровни p21 (Bhunia et al, 2002; Kim et al, 2004; Li et al, 2005; Low et al, 2006 г.). Соответственно, количество активно циркулирующих клеток в кистозном эпителии всегда заметно увеличивается в Pkd1 – или Pkd2 -нулевых почках по сравнению с почками дикого типа (Zhou, 2009). Однако, несмотря на повышенную пролиферацию кистозных клеток, на животных моделях ADPKD или тканях пациентов с ADPKD нет грубых цилиарных аномалий, за заметным исключением более длинных ресничек в медленно прогрессирующей гипоморфной мышиной модели патогенной мутации человека (Hopp и др., 2012).Это наблюдение предполагает, что сильно пролиферирующие кистозные клетки, по-видимому, утратили способность поддерживать координацию прогрессии клеточного цикла и обновления ресничек. Эти данные также согласуются с идеей, что постоянная митогенная передача сигналов на основе ресничек может поддерживать пролиферацию клеток и экспансию кист в клетках, лишенных Pkd1 или Pkd2 . Фактически, мыши с двойными мутантами, лишенные одного из генов полицистина и гена, необходимого для образования ресничек, ift20 или Kif3a , демонстрируют гораздо менее тяжелый фенотип с точки зрения образования кист и пролиферации клеток по сравнению с одиночные мутанты (Ma et al, 2013).Соответственно, ускорение разборки ресничек (Nikonova et al, 2018) подавляет рост кисты и улучшает функцию почек, тогда как замедление разборки ресничек имеет противоположные эффекты в моделях ADPKD у мышей (Nikonova et al, 2014).

Наши исследования, представленные здесь, показывают, что делеция Pkd1 или Pkd2 в нескольких клеточных линиях и MEF приводит к ингибированию индуцированной сывороткой разборки и / или шедирования ресничек и стойкой активации передачи сигналов на основе ресничек.Отсроченная разборка также наблюдается в модели ADPKD у мышей в послеродовой период. Задержка разборки, вызванная потерей Pkd1 , является вторичной по отношению к активации пути центросомной целостности / митотического наблюдения (CI / MS), включающего ось 53BP1-USP28-p53.

Результаты

Удаление

Pkd1 / 2 вызывает отсроченную разборку ресничек

Мы создали и охарактеризовали мышиную модель ADPKD с использованием индуцируемого тамоксифеном Ubc-Cre ^ERT2 d удалили драйвер ген глобально (и).Как сообщалось ранее (Piontek et al, 2007; Ma et al, 2013), пролиферация клеток была заметно увеличена в кистозных почках, а количество EdU-положительных эпителиальных клеток почек было выше у 21-дневного возраста Ubc-Cre ^ERT2 ; Pkd1 ^{f / f} мышей, индуцированных 4-гидрокситамоксифеном (4-OHT), по сравнению с однопометными животными дикого типа. Кроме того, мы заметили, что количество EdU-положительных клеток с первичными ресничками увеличивалось в три раза в мутантных почках по сравнению с почками дикого типа ().Чтобы дополнительно проверить, имеют ли кистозные клетки более длинные реснички в S фазе, чем клетки дикого типа, срезы почек были дважды помечены на реснички и GEMININ, белок, который накапливается в S фазе (McGarry & Kirschner, 1998). ГЕМИНИН-положительные клетки с ресничками или без них очень редко встречались в почках дикого типа. Однако GEMININ-позитивные клетки с ресничками были легко идентифицированы в Pkd1 -нулевых почках (). Эти данные повышают вероятность того, что разборка может быть нарушена или сильно задержана в мутантных клетках.

Делеция Pkd1 увеличивает количество реснитчатых клеток EdU ⁺ in vivo.

(A) Схема, показывающая введение 4-гидрокситамоксифена (4-OHT) от P2 к P6 и внутрибрюшинную инъекцию EdU на P20. (B) Типичные изображения срезов почек, окрашенных на EdU (зеленый) и ацетилированный α-тубулин (реснички, красный) P21 Pkd1 ^{f / f} или Ubc-Cre ^ERT2 ; Pkd1 ^{f / f} мышей, индуцированных 4-OHT от P2 к P6.Стрелками обозначены клетки EdU ⁺ с ресничками. Звездочки обозначают кисты. Масштабные линейки: 5 мкм. (C) Процент клеток EdU ⁺ с ресничками в Pkd1 ^{f / f} (n = 3) и Ubc-Cre ^ERT2 ; Fkd1 f / 9018 (n = 4) почек. 50–100 клеток EdU ⁺ на животное оценивали на наличие ресничек. Данные представлены как средние ± стандартная ошибка среднего. t тест, **** P <0.0001.

Описание модели мыши UbcCre ^ERT2 ; Pkd1 ^{f / f} .

(A, B) Отношение веса двух почек к массе тела (2 кВт / масса тела) (A) и определение происхождения кисты в P21 Pkd1 ^{f / f} или UbcCre ^ERT2 ; Pkd1 ^{f / f} мышей (B), индуцированных тамоксифеном из P2-P6. Lotus Tetragonolobus Lectin маркирует проксимальные канальцы, а Dolichos Biflorus Agglutinin маркирует собирающие протоки.Масштабные линейки: 30 мкм. Данные представлены как средние ± стандартная ошибка среднего. t test, **** P <0,0001. (C) Типичные изображения срезов почек, окрашенных на ацетилированный α-тубулин (реснички, зеленый) и GEMININ (красный) из P21 Pkd1 ^{f / f} или Ubc-Cre ^ERT2 ; Pkd1 ^{f / f} мышей, индуцированных 4-OHT от P2 к P6. Стрелки указывают на ГЕМИНИН-положительные клетки. Масштабные линейки: 5 мкм.

Разборка или выпадение ресничек – это динамический процесс, который трудно повторить in vivo.Поэтому мы непосредственно проверили влияние делеции Pkd1 или Pkd2 на индуцированную сывороткой децилизацию в культуре клеток. Поскольку потеря / укорочение ресничек в ответ на сыворотку может быть опосредовано постепенной резорбцией / разборкой ресничек (Пугачева и др., 2007), мгновенным расслоением и / или отслаиванием (Мирвис и др., 2019), мы оценивали клеточные культуры на основе наличия или отсутствие детектируемых ресничек, чтобы объяснить все способы потери ресничек. С этого момента мы адаптируем термин «децилиация» для включения всех форм потери ресничек.Мы использовали три разных типа клеток: MEF, фибробласты NIh4T3 и почечные эпителиальные клетки мыши (mIMCD3). Делеция Pkd1 или Pkd2 , достигнутая либо путем гомологичной рекомбинации в MEF, либо путем редактирования гена CRISPR / Cas9 в NIh4T3 () и mIMCD3 (Kleene & Kleene, 2016), не повлияла на процент мерцательных клеток или длину ресничек после 48 лет. ч сывороточного голодания (), что указывает на отсутствие эффекта делеции Pkd1 или Pkd2 на сборку ресничек.Однако делеция Pkd1 или Pkd2 значительно снижает скорость индуцированной сывороткой децилитации во всех типах клеток, несмотря на различную кинетику среди этих типов клеток (и).

Отсроченная разборка первичных ресничек в разных типах клеток Pkd1- или Pkd2-null .

(A) Инактивация Pkd1 путем редактирования гена CRISPR / Cas9 в клетках NIh4T3. PKD1 иммунопреципитировали из лизатов клеток NIh4T3 дикого типа (дорожка 1) или стабильного клона NIh4T3 (клон 9.7) трансфицировали Pkd1 -специфической единственной направляющей РНК, нацеленной на экзон 1 (дорожка 2), с использованием двух ранее охарактеризованных PKD1-специфических антител (7e12 и E4). Присутствие PKD1 в иммунокомплексах определяли иммуноблоттингом с использованием третьего PKD1-специфического антитела (E8) (верхняя панель). Секвенирование по Сэнгеру экзона 1 мыши Pkd1 в клетках NIh4T3 ^Pkd1-KO выявило индели вокруг сайта расщепления Cas9 (показаны красным) в четырех обнаруженных аллелях Pkd1 .Последовательности дикого типа не обнаружено. Для справки вверху показана последовательность дикого типа. (B) Уровни белка PKD2 в клонах NIh4T3 дикого типа или изолированных клонах NIh4T3, стабильно трансфицированных Pkd2 -специфической единственной направляющей РНК, нацеленной на экзон 8. Клон 5.4 продемонстрировал полное истощение PKD2 и был использован для последующих экспериментов. Секвенирование по Сэнгеру экзона 8 мыши Pkd2 в клетках NIh4T3 ^Pkd2-KO (клон 5.4) выявило большую делецию вокруг сайта расщепления Cas9 (показано красным).Последовательности дикого типа не обнаружено. Для справки вверху показана последовательность дикого типа. (C) Анализ длины ресничек в клетках дикого типа, Pkd1- или Pkd2- нулевых NIh4T3 клеток после 48 часов сывороточного голодания (~ 100 первичных ресничек проанализировано на группу). Данные представлены как средние ± стандартная ошибка среднего. Односторонний дисперсионный анализ с тестом множественных сравнений Холма – Сидака. (D, E) Репрезентативные изображения клеток MEF дикого типа ( Pkd1 ^{+ / +} ) или Pkd1-null ( Pkd1 ^{– / –} ) клеток MEF через 0 или 8 часов после рестимуляции сыворотки окрашивали на Arl13b (зеленый) и γ-тубулин (красный) для визуализации аксонемы ресничек и базального тельца соответственно (D). (E) Уровни дециляции, вызванной сывороткой, показаны как наиболее подходящие с 95% доверительным интервалом для указанных типов клеток (n = 6) (E). Масштабные линейки: 5 мкм. Данные представлены как средние ± стандартная ошибка среднего. Двусторонний дисперсионный анализ с тестом множественных сравнений Холма – Сидака. *** P <0,001, **** P <0,0001. (F, G) Репрезентативные изображения клеток Pkd2-null mIMCD3 дикого типа через 0 или 8 ч после рестимуляции сывороткой, окрашенных на Arl13b (зеленый) и γ-тубулин (красный) для визуализации аксонемы ресничек и базального тельца соответственно (F). (G) Уровни дециляции, вызванной сывороткой, показаны как наиболее подходящие с 95% доверительным интервалом для указанных типов клеток (n = 3) (G). Масштабные линейки: 5 мкм. Данные представлены как средние ± стандартная ошибка среднего. Двусторонний дисперсионный анализ с тестом множественных сравнений Холма – Сидака. *** P <0,001, **** P <0,0001.

Исходные данные доступны для этого рисунка.

Удаление Pkd1 или Pkd2 снижает скорость децилирования ячейки.

(A, B, C, D) Репрезентативные изображения клеток дикого типа или Pkd1-null NIh4T3 клеток (A) и дикого типа или Pkd2-null клеток NIh4T3 клеток (C) в 0 или 24 часа после рестимуляции сыворотки окрашивали на Arl13b (зеленый) и γ-тубулин (красный) для визуализации аксонемы ресничек и базального тельца соответственно.Скорость индуцированного сывороткой децилирования показана как наиболее подходящая с 95% доверительным интервалом для указанных типов клеток (n = 3) (B, D). Масштабные линейки: 5 мкм. Данные представлены как средние ± стандартная ошибка среднего. Двусторонний дисперсионный анализ с тестом множественных сравнений Холма – Сидака. * P <0,05, *** P <0,001, **** P <0,0001. (E, F, G, H) Репрезентативные изображения клеток дикого типа, Pkd1, – или Pkd2, , нулевых клеток NIh4T3, трансфицированных указанными конструкциями и GFP через 24 часа после повторного добавления сыворотки (E, G ).Клетки GFP ⁺ (зеленые, вставки) оценивали на наличие первичных ресничек с помощью окрашивания Arl13b (красный). Скорости индуцированной сывороткой дециляции показаны как наиболее подходящие с 95% доверительным интервалом для указанных типов клеток (n = 3) (F, H). Масштабные линейки: 5 мкм. Данные представлены как средние ± стандартная ошибка среднего. Двусторонний дисперсионный анализ с тестом множественных сравнений Холма – Сидака. Все сравнения были выполнены относительно временных точек контрольной группы ( NIh4T3 ^Pkd1-KO , трансфицированный pcDNA3 или NIh4T3 ^Pkd2-KO , трансфицированный pcDNA3, красные кривые).Цвет звездочек указывает на сравнение соответствующей цветовой группы с контрольной группой. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, **** P <0,0001.

Чтобы проверить, являются ли эти эффекты на децилирование специфическими для PKD1 или PKD2, а не из-за «нецелевых» эффектов CRISPR / Cas9, мы трансфицировали обратно дикого типа или мутантные формы PKD1 или PKD2. Добавление обратно человеческих PKD1 или PKD2 скорректировало отсроченную децилиацию, указывая на специфический эффект PKD1 или PKD2 на децилирование.Напротив, трансфекция PKD1 ^S99I , патогенного мутанта PKD1, который не может должным образом перемещаться к плазматической мембране (Kim et al, 2016), PKD2 ^D511V , патогенного мутанта PKD2 (Reynolds et al, 1999; Koulen et al, 2002) или PKD2 ^Y684del , которые оба демонстрируют сниженную активность каналов (Zheng et al, 2018), не смогли спасти отсроченную индуцированную сывороткой децилизацию (). Эти результаты подтверждают, что наблюдаемая задержка разборки ресничек специфична для отсутствия любого из полицистинов и устраняется добавлением обратно белков дикого типа.Более того, они поддержали гипотезу о том, что полностью функциональный комплекс PKD1 / PKD2, с точки зрения правильного нацеливания на плазматическую мембрану и бескомпромиссной активности каналов, необходим для правильного децилирования.

Пути

p53 и TGFβ / Smad гиперактивированы в нулевых клетках

Pkd1 – и Pkd2

Чтобы получить представление о механизме замедленного децилирования, а также идентифицировать гиперактивированные сигнальные пути в клетках Pkd1 – или Pkd1 – или Pkd1 – или мы проверили платформу из 45 сигнальных путей (Cignal Reporter Assays; QIAGEN) на предмет их модуляции путем инактивации Pkd1 или Pkd2 .Хотя кинетика кистозного роста может отличаться в почках Pkd1 и мутантных почек Pkd2 , мы сосредоточили внимание на путях, которые показали аналогичное направление изменения активности пути в нулевых клетках Pkd1 и Pkd2 по сравнению с клетками дикого типа, несмотря на разные уровни. Гиперактивация путей p53 и TGFβ / Smad выделялась тем, что они были гиперактивированы в 10/10 независимых экспериментах () в клетках NIh4T3, лишенных PKD1 или PKD2, и клетках mIMCD3, лишенных PKD2.Другие пути также были активированы в мутантных клетках (т.е. ATF6, Hedgehog / Gli, E2F1, MYC и TCF / LEF). Однако пути, такие как путь MEF2, по-разному реагировали на делецию Pkd1 по сравнению с Pkd2 . Делеция Pkd2 активируется, тогда как делеция Pkd1 подавляет активность пути MEF2, что указывает на то, что делеция Pkd1 или Pkd2 не полностью перекрывает активность пути. Соответственно, специфический для почек нокаут Mef2c снижает рост кист в Pkd2 -нулевых почках (Xia et al, 2010).Было бы интересно изучить кистозный рост у сложных мышей Pkd1 / Mef2c . Путь TGFβ / Smad2, как известно, гиперактивируется в почках, лишенных Pkd1 (Hassane et al, 2010; Leonhard et al, 2016), и вызывает фиброз почек, распространенный признак кистозных почек. Также известно, что он способствует пролиферации клеток NIh4T3 (Benzakour et al, 1992). Здесь наиболее актуально то, что для максимальной активности необходима интактная ресничка (Clement et al, 2013). Поэтому мы исследовали, проявляет ли он пролонгированную активность в ответ на сыворотку в клетках Pkd1, -null NIh4T3 по сравнению с клетками дикого типа.Уровни активированного фосфо-Smad2 (p-Smad2) определяли в несколько временных точек во время индуцированной сывороткой разборки ресничек в клетках дикого типа или Pkd1 -нулевых клетках NIh4T3, ранее синхронизированных в G1 / G0 (). После сывороточного голодания Smad2 не активировался в клетках дикого типа или мутантных клетках, что указывает на отсутствие эндогенно секретируемых лигандов суперсемейства TGF. Через 1 час после повторного добавления сыворотки уровень активации Smad2 был одинаковым для обоих типов клеток. Однако во все последующие моменты времени уровни p-Smad2 были выше в мутантных клетках, что указывает на постоянную активацию Smad2 во время разборки.Эти данные согласуются с уменьшенными скоростями дециляции -нулевых клеток Pkd1 .

Повышенная передача сигналов p53 и TGFβ / Smad в Pkd1 -нулевых клетках NIh4T3.

(A) Сводные данные функционального экрана для сигнальных путей, модулированных инактивацией Pkd1 или Pkd2 . Складчатая индукция на клетках дикого типа (показаны зеленой пунктирной линией) указанных сигнальных путей в NIh4T3 ^Pkd1-KO (n = 4), NIh4T3 ^Pkd2-KO (n = 3) или mIMCD3 ^Pkd2-KO (n = 3).Пути TGFβ / Smad и p53 (обведены) последовательно индуцировались во всех 10 независимых экспериментах. (B) Характерная динамика активации Smad2 (фосфо-SMAD2 на 465 и 467) в ответ на повторное добавление сыворотки в клетках NIh4T3 дикого типа и Pkd1- нулевых. (C) Сводные данные (B), показанные как наиболее подходящие с 95% доверительным интервалом для указанных типов клеток (n = 3). Данные представлены как средние ± стандартная ошибка среднего. Двусторонний дисперсионный анализ с тестом множественных сравнений Холма – Сидака. * P <0.05, ** P <0,01, *** P <0,001.

Исходные данные доступны для этого рисунка.

Ингибирование p53 восстанавливает отсроченную децилиляцию в

Pkd1 – или Pkd2 -null NIh4T3 клетках

Анализ сигнального пути идентифицировал p53 как один из путей, гиперактивируемых в клетках Pkd1 или Pkd2 . Мы подтвердили, что уровни экспрессии p53 были выше в Pkd1 – или Pkd2 -нулевых клетках, чем в клетках дикого типа ().Затем мы определили, были ли уровни p53 повышены в кистозных почках у 21-дневного возраста Ksp-Cre ^ERT2 ; Pkd1 ^{f / f} и в 16- или 21-дневном возрасте. – старый Ubc-Cre ^ERT2 ; Pkd1 ^{f / f} мышей. Сначала мы охарактеризовали модель мыши Ksp-Cre ^ERT2 ; Pkd1 ^{f / f} (). В то время как Ubc-Cre управляет экспрессией рекомбиназы Cre во всех типах клеток, Ksp-Cre ^ERT2 использует промотор Cdh26 , который активен в эпителиальных клетках развивающихся нефронов, зачатке мочеточника, и мезонефрические канальцы с низкой эффективностью рекомбинации в проксимальных канальцах (Shao et al, 2002).Во взрослых почках этот промотор активен в собирательных трубках, петлях Генле и дистальных канальцах, а также в проксимальных канальцах (Shao et al, 2002; Shibazaki et al, 2008). Этот драйвер индуцируется тамоксифеном (4-OHT). В поддержку наших данных в культуре клеток, уровни экспрессии белка p53 в лизатах кистозных почек P21 Ksp-Cre ^ERT2 ; Pkd1 ^{f / f} и P16 или P21 Ubc-Cre. ^ERT2 ; Pkd1 ^{f / f} мышей, индуцированных 4-OHT из P2-P6, были увеличены в мутантных почках (и), что позволяет предположить, что делеция Pkd1 повсеместно или специфически в эпителиальные клетки почек вызывают массивную активацию р53 в кистозных почках.

Сывороточная децилиция зависит от р53 в Pkd1 -нулевых клетках NIh4T3.

(A) Уровни экспрессии p53 в общих клеточных лизатах дикого типа, Pkd1 -null или Pkd2 -null NIh4T3 клетках. (B) Уровни экспрессии p53 в ядерных и цитозольных экстрактах, полученных из почек P21 из Pkd1 ^{f / f} и Ubc-Cre ^ERT2 ; Pkd1 f мышей, получавших 4-OHT. (C, D) Количественная оценка уровней белка p53 в ядре (C) и цитозоле (D), нормализованных для однопометников дикого типа, объединенных из трех пар P16 и трех пар P21 однопометников. Данные представлены как средние ± стандартная ошибка среднего. т проба. * P <0,05, ** P <0,01. (E, F) Типичные изображения Pkd1- нулевых клеток NIh4T3 (E), котрансфицированных указанными конструкциями и GFP через 24 часа после повторного добавления сыворотки. pcDNA3 использовали в качестве отрицательного контроля. px330 p53 экспрессирует p53-специфичную однопроводную РНК. Клетки GFP ⁺ (зеленые, вставки) оценивали на наличие первичных ресничек с помощью окрашивания Arl13b (красный). Уровни децилиляции, вызванной сывороткой, показаны как наиболее подходящие с 95% доверительным интервалом для указанных типов клеток (n = 3) (F). Масштабные линейки: 5 мкм. Данные представлены как средние ± стандартная ошибка среднего. Двусторонний дисперсионный анализ с тестом множественных сравнений Холма – Сидака. * P <0,05, **** P <0,0001. (G, H, I) Схема, показывающая лечение 10 мкМ пифитрином во время сывороточного голодания и во время рестимуляции сыворотки (G).Репрезентативные изображения первичных ресничек (Arl13b, красный) из нулевых клеток Pkd1- (H) через 24 часа после рестимуляции сыворотки после указанного лечения. Показатели индуцированной сывороткой децилитации показаны как наиболее подходящие с 95% доверительным интервалом для указанных типов клеток (n = 3) (I). Стрелками обозначены первичные реснички. Масштабные линейки: 5 мкм. Данные представлены как средние ± стандартная ошибка среднего. Двусторонний дисперсионный анализ с тестом множественных сравнений Холма-Сидака. * P <0,05, ** P <0,01. (J, K, L) Диаграмма, показывающая обработку 10 мкМ пифитрина только во время рестимуляции сыворотки (J).Репрезентативные изображения первичных ресничек (Arl13b, красный) из нулевых клеток Pkd1- (K) через 24 часа после рестимуляции сывороткой после указанного лечения. Скорости индуцированной сывороткой децилиляции показаны как наиболее подходящие с 95% доверительным интервалом для указанных типов клеток (n = 3) (L). Стрелками обозначены первичные реснички. Масштабные линейки: 5 мкм. Данные представлены как средние ± стандартная ошибка среднего. Двусторонний дисперсионный анализ с тестом множественных сравнений Холма – Сидака. ** P <0,01, **** P <0,0001.

Исходные данные доступны для этого рисунка.

Описание модели мыши KspCre ^ERT2 ; Pkd1 ^{f / f} .

(A, B) Соотношение 2 кВт / масса (A) и визуализация происхождения кисты в Pkd1 ^{f / f} или KspCre ^ERT2 ; fkd1 мышей на P21 (B), индуцированных тамоксифеном от P2 до P6. Lotus Tetragonolobus Lectin маркирует проксимальные канальцы, а Dolichos Biflorus Agglutinin маркирует собирающие протоки.Масштабные линейки: 30 мкм. Данные представлены как средние ± стандартная ошибка среднего. t test, **** P <0,0001. (C, D, E) Уровни экспрессии p53 в ядерных и цитозольных экстрактах, полученных из почек P21 Pkd1 ^{f / f} и Ksp-Cre ^ERT2 ; Pkd1 f / f мышей, получавших 4-OHT (C). (D, E) Количественная оценка уровней белка p53 в ядре (D) и цитозоле (E), нормализованных для однопометников дикого типа (три пары однопометников).Данные представлены как средние ± стандартная ошибка среднего. t тест, ** P <0,01.

Исходные данные доступны для этого рисунка.

Поскольку PKD1 и PKD2 присутствуют в первичных ресничках (Yoder et al, 2002; Pazour et al, 2002b), а образование и рост кист, вызванные делецией Pkd1 или Pkd2 , имеют несколько общих характеристик цистогенеза у мутантов ресничек ( Davenport et al, 2007; Piontek et al, 2007), мы пришли к выводу, что потеря Pkd1 или Pkd2 могла привести к некоему структурному дефекту ресничек и / или центросомы / базального тельца, который может быть обнаружен центросомная целостность / путь митотического наблюдения, ведущий к активации p53.Этот путь активируется потерей центросом, а не амплификацией центросом или повреждением ДНК (Fong et al, 2016; Lambrus et al, 2016; Meitinger et al, 2016; Lambrus & Holland, 2017). В соответствии с этой гипотезой мы не обнаружили различий в количестве фосфо-h3AX (γ-h3AX) -положительных клеток дикого типа и Pkd1 -нулевых клеток NIh4T3 или окрашивания почек дикого типа и мутантных почек (), что указывает на то, что ДНК удваивается. -цепочечные разрывы и геномная нестабильность вряд ли могут объяснить задержку разборки в мутантных клетках.Основные компоненты пути CI / MS включают 53BP1, USP28 и p53. Инактивация гена p53 посредством редактирования гена CRISPR / Cas9 (и) или ингибирование его транскрипционной активности пифитрином (и) восстанавливала отсроченную децилизацию в Pkd1 – или Pkd2 -нулевых клетках NIh4T3. Добавление пифитрина сразу после повторного добавления сыворотки имело аналогичные эффекты в Pkd1 – или Pkd2 -нулевых клетках (и), что указывает на острый эффект p53 на децилирование в фазах G1 и / или S того же цикла.Делеция или ингибирование p53 не влияли на клетки дикого типа (). Таким образом, эти данные показали, что делеция Pkd1 или Pkd2 в культивируемых клетках или почках приводит к увеличению уровней p53 и активности, которая отвечает за ингибирование индуцированной сывороткой децилитации клеток.

Активация ответа на повреждение ДНК в клетках дикого типа и Pkd1 -нулевых клетках и почках.

(A, B) Репрезентативные изображения клеток NIh4T3 дикого типа и Pkd1 -null (A) или Pkd1 ^{f / f} и UbcCre ^{ERT2 ; f / f срезы почек мыши на P21 (B), окрашенные на γ-h3AX (красный).Стрелка указывает на клетку, положительную по γ-h3AX. Масштабные линейки: 5 мкм.}

Эффект делеции p53 или ингибирование индуцированной сывороткой децилиции нулевых клеток Pkd2 или клеток NIh4T3 дикого типа.

(A, B) Типичные изображения Pkd2 -нулевых клеток NIh4T3 (A), котрансфицированных указанными конструкциями и GFP через 24 часа после повторного добавления сыворотки. Клетки GFP ⁺ (зеленые, вставки) оценивали на наличие первичных ресничек с помощью окрашивания Arl13b (красный).Показатели индуцированной сывороткой децилиляции показаны как наиболее подходящие с 95% доверительным интервалом для указанных типов клеток (n = 3) (B). Масштабные линейки: 5 мкм. Данные представлены как средние ± стандартная ошибка среднего. Двусторонний дисперсионный анализ с тестом множественных сравнений Холма – Сидака. *** P <0,001, **** P <0,0001. (C, D, E, F) Типичные изображения Pkd2 -null NIh4T3 клеток, обработанных ДМСО или пифитрином во время сывороточной депривации и рестимуляции сыворотки (C) или обработанных DMSO или пифитрином только во время рестимуляции сыворотки (E).Клетки оценивали на наличие первичных ресничек с помощью окрашивания Arl13b (красный). Скорости индуцированной сывороткой децилиляции показаны как наиболее подходящие с 95% доверительным интервалом для указанных типов клеток (n = 3) (D, F). Масштабные линейки: 5 мкм. Данные представлены как средние ± стандартная ошибка среднего. Двусторонний дисперсионный анализ с тестом множественных сравнений Холма – Сидака. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, **** P <0,0001. (G, H, I) Скорость индуцированной сывороткой децилиляции клеток NIh4T3 дикого типа, трансфицированных GFP и pcDNA3 или px330 p53 (G), или обработанных DMSO или пифитрином во время депривации сыворотки и рестимуляции сыворотки (H), или обработанные ДМСО или пифитрином только во время рестимуляции сыворотки (I), показаны как наиболее подходящие с 95% доверительным интервалом (n = 3).Данные представлены как средние ± стандартная ошибка среднего. Двусторонний дисперсионный анализ с тестом множественных сравнений Холма – Сидака.

Затем мы проверили, будет ли истощение 53BP1 и USP28 иметь аналогичные эффекты с делецией p53 на децилирование в -нулевых клетках Pkd1 . Хотя это не является статистически значимым, уровни мРНК как 53bp1 , так и Usp28 были повышены в лишенных сыворотки нулевых клетках Pkd1 по сравнению с клетками дикого типа (). Эта тенденция к увеличению уровней мРНК Usp28 и 53bp1 на исходном уровне (0 ч) может указывать на активацию CI / MS перед повторным добавлением сыворотки.Подавление обоих этих белков () восстанавливает децилирование в мутантных клетках (). В целом, эти данные предполагают, что делеция Pkd1 или Pkd2 ведет к активации пути CI / MS, что, в свою очередь, ведет к активации активности p53 для подавления децилитации. Повышенные уровни мРНК 53bp1 и Usp28 в G1 / G0 предполагают, что центросомный «дефект» мог быть индуцирован раньше, но он не проявлялся до тех пор, пока клетки не были индуцированы децилироваться.Мы предположили, что сверхэкспрессия основных компонентов пути CI / MS в клетках NIh4T3 дикого типа должна быть способна повторять задержку децилирования, наблюдаемую в Pkd1-нулевых клетках . Действительно, сверхэкспрессия USP28, 53BP1, как USP28, так и 53BP1 или p53 была способна подавлять децилизацию в клетках дикого типа (2). В целом, эти результаты подтверждают вывод, что активация пути CI / MS ингибирует децилиацию, а не наоборот.

Скорость индуцированного сывороткой децилирования модулируется компонентами центросомной целостности / пути митотического наблюдения.

(А, В)
Уровни мРНК Usp28 (A) и 53bp1 (B) в клетках дикого типа или Pkd1-нулевых клетках NIh4T3 в различные моменты времени после повторного добавления сыворотки (n = 3). Данные представлены как средние ± стандартная ошибка среднего. Двусторонний дисперсионный анализ с тестом множественных сравнений Холма – Сидака. (C, D) Репрезентативные изображения нулевых клеток Pkd1-, трансфицированных указанными конструкциями и GFP, через 24 часа после повторного добавления сыворотки (C). Клетки GFP ⁺ (зеленые, вставки) оценивали на наличие первичных ресничек с помощью окрашивания Arl13b (красный) (C).Уровни децилирования, вызванного сывороткой, показаны как наиболее подходящие с 95% доверительным интервалом для указанных типов клеток (n = 3) (D). Масштабные линейки: 5 мкм. Данные представлены как средние ± стандартная ошибка среднего. Двусторонний дисперсионный анализ с тестом множественных сравнений Холма – Сидака. Все сравнения выполняли относительно временных точек контрольной группы ( NIh4T3 ^Pkd1-KO , трансфицированных скремблированной миРНК, красная кривая). Цвет звездочек указывает на сравнение соответствующей цветовой группы с контрольной группой.** P <0,01, *** P <0,001, **** P <0,0001. (E, F) Репрезентативные изображения клеток NIh4T3 дикого типа, трансфицированных указанными конструкциями и GFP, через 24 часа после повторного добавления сыворотки. Клетки GFP ⁺ (зеленые, вставки) оценивали на наличие первичных ресничек с помощью окрашивания Arl13b (красный) (E). Уровни децилиляции, вызванной сывороткой, показаны как наиболее подходящие с 95% доверительным интервалом для указанных типов клеток (n = 3) (F). Масштабные линейки: 5 мкм.Все сравнения проводились с контрольными временными точками (NIh4T3, трансфицированный pcDNA3 , черная кривая). Цвет звездочек указывает на сравнение соответствующей цветовой группы с контрольной группой. Данные представлены как средние ± стандартная ошибка среднего. Двусторонний дисперсионный анализ с тестом множественных сравнений Холма – Сидака. * P <0,05, ** P <0,01, **** P <0,0001.

Подтверждение эффективности нокдауна миРНК Usp28 и 53bp1 .

(A, B) Эффективность миРНК Usp28 была подтверждена с помощью вестерн-блоттинга после трансфекции скремблированной миРНК или возрастающих количеств миРНК Usp28 (15, 30 и 50 нМ) (A) и с помощью иммунофлуоресценции для USP28 (красный) в Pkd1 -нулевых клетках NIh4T3 (B). (C, D) Эффективность миРНК 53bp1 была подтверждена с помощью вестерн-блоттинга после трансфекции скремблированной миРНК или 50 нМ 53bp1 миРНК (C) и с помощью иммунофлуоресценции для 53BP1 (красный) в клетках Pkd1 -null D).Масштабные линейки: 5 мкм.

Исходные данные доступны для этого рисунка.

Pkd1 -null клетки обнаруживают пониженные уровни NDE1 во время индуцированной сывороткой децилиации

Чтобы понять, как повышенная активность p53 может ингибировать децилизацию, мы исследовали уровни экспрессии известных факторов разборки или негативных регуляторов образования ресничек. NDE1 является негативным регулятором цилиогенеза, экспрессия которого индуцируется при повторном входе в клеточный цикл, но подавляется в G1 / G0 с помощью SCF ^FBW7 E3 лигазы (Maskey et al, 2015).Нулевые клетки Pkd1 показали пониженные уровни NDE1 при повторном добавлении сыворотки по сравнению с клетками дикого типа (). Чтобы дополнительно проверить возможную роль p53 в снижении уровней экспрессии белка NDE1 во время децилиляции, мы обработали клетки NIh4T3 дикого типа нутлином, стабилизатором p53, сразу после рестимуляции сыворотки, и определили уровни белка NDE1 через 24 часа и процентное соотношение ресничек через 8 и 24 ч после повторного добавления сыворотки. Обработка нутлином снизила уровни белка NDE1 и децилизацию клеток в клетках NIh4T3 дикого типа ().Эти данные свидетельствуют о том, что повышенная активность p53 может подавлять уровни белка NDE1. Однако, поскольку децилирование подавлялось при концентрациях нутлина, которые были неэффективны в подавлении уровней NDE1 (20 мкМ), мы предполагаем, что другие белки, регулируемые p53, могут быть затронуты параллельно с NDE1, чтобы подавить децилизацию в этих клетках.

p53 играет отрицательную роль в разборке ресничек посредством подавления NDE1.

(A) Репрезентативная динамика уровней белка различных факторов разборки во время децилитации в ответ на повторное добавление сыворотки в клетках дикого типа и Pkd1- нулевых клетках NIh4T3. (B) Сводные данные об уровнях белка NDE1 в (A), показанные как наиболее подходящие с 95% доверительным интервалом для указанных типов клеток (n = 3). Данные представлены как средние ± стандартная ошибка среднего. Двусторонний дисперсионный анализ с тестом множественных сравнений Холма – Сидака. * P <0,05, ** P <0,01. (C) Внизу: репрезентативные уровни белка NDE1 в клетках NIh4T3 дикого типа через 0 или 24 часа после стимуляции сывороткой после указанных обработок. Вверху: сводные данные об уровнях NDE1, нормализованные для имитации лечения через 24 часа (серая полоса) (n = 3).Данные представлены как средние ± стандартная ошибка среднего. Односторонний дисперсионный анализ с тестом множественных сравнений Холма – Сидака, ** P <0,01, *** P <0,001, **** P <0,0001. (D, E) Репрезентативные изображения клеток NIh4T3 дикого типа через 24 часа после повторного добавления сыворотки после указанных обработок. Первичные реснички визуализировали с помощью Arl13b (зеленый) (D). Показатели децилитации, вызванной сывороткой, показаны как наиболее подходящие с 95% доверительным интервалом для указанных видов лечения (n = 3) (E). Масштабные линейки: 5 мкм.Данные представлены как средние ± стандартная ошибка среднего. Двусторонний дисперсионный анализ с тестом множественных сравнений Холма – Сидака. * P <0,05, *** P <0,001. (F, G, H, I) Графическое представление конструкций, кодирующих FLAG-GEMININ или FLAG-NDE1-GEMININ (F). Экспрессию конструкций индуцировали индукцией доксициклина в момент времени 0 ч (G). Репрезентативные изображения Pkd1-нулевых клеток NIh4T3 через 24 ч после повторного добавления сыворотки, трансфицированных указанными конструкциями.Клетки dsRED ⁺ (красные) оценивали на наличие первичных ресничек с помощью окрашивания Arl13b (зеленый) (H). Уровни децилитации, вызванной сывороткой, показаны как наиболее подходящие с 95% доверительным интервалом для указанных видов лечения (n = 3) (I). Масштабные линейки: 5 мкм. Данные представлены как средние ± стандартная ошибка среднего. Двусторонний дисперсионный анализ с тестом множественных сравнений Холма – Сидака. *** P <0,001.

Исходные данные доступны для этого рисунка.

Мы рассудили, что добавление обратно NDE1 в Pkd1 -null клетках должно способствовать децилиляции, если низкие уровни NDE1 играли причинную роль в снижении скорости децилитации, наблюдаемой в этих клетках.Однако сверхэкспрессия NDE1 на протяжении клеточного цикла оказывает сильное влияние на подавление ресничек. Чтобы максимизировать экспрессию NDE1 в фазе G1 / S (когда происходит децилиция), мы использовали индуцируемый тетрациклином вектор, чтобы вызвать экспрессию NDE1 во время повторного добавления сыворотки. Мы также слили на его С-конце аминокислотные остатки 1–110 человеческого GEMININ, содержащие хорошо зарекомендовавший себя фосфодегрон APC / C (McGarry & Kirschner, 1998), чтобы гарантировать почти полную деградацию на G0 (). Как показано на фигуре, процент мерцательных клеток через 12 и 24 ч после повторного добавления сыворотки в Pkd1 -нулевых клетках NIh4T3, трансфицированных NDE1-hGEM и индуцированных 2 мкг / мл доксициклина в момент времени 0, был снижен до уровней дикого типа.Сверхэкспрессия этой конструкции и индукция экспрессии схожей концентрацией доксициклина не ускоряли разборку в клетках дикого типа. Мы пришли к выводу, что уровни ресничек в мут-трансфицированных и NDE1-hGEM-трансфицированных Pkd1 -нулевых клетках одинаковы в 0 ч повторного добавления сыворотки, но децилиция усиливается после повторного добавления сыворотки в мутантных клетках, трансфицированных NDE1-hGEM , NDE1 может функционировать как индуцированный сывороткой фактор дециляции, и его наблюдаемое подавление в Pkd1 -нулевых клетках может иметь причинный эффект в подавлении скорости децилирования в этих клетках.В целом, эти данные предполагают, что NDE1 может функционировать ниже PKD1 в сывороточной децилиации в клетках NIh4T3.

Обсуждение

Хотя 18 лет назад было осознано, что реснички могут играть важную роль в патогенезе поликистозной болезни почек (Pazour & Rosenbaum, 2002; Pazour et al, 2002a), точный клеточный механизм того, как реснички вносят вклад в кисту формирование / прогрессирование ADPKD все еще остается неизвестным. Поскольку реснички кажутся нормального размера на нескольких моделях ADPKD у мышей, считается, что потеря полицистинов может играть первичную роль в модуляции функции ресничек, а не структуры (Nauli et al, 2003; Pazour, 2004; Ma et al, 2013).Наши исследования оспаривают эту идею, показывая, что измененная функция ресничек вторична по отношению к дефектной дециляции. Это согласуется с предыдущими данными, показывающими, что абляция первичных ресничек (Ma et al, 2013) или ускорение разборки ресничек подавляет рост кисты (Nikonova et al, 2018), тогда как замедление разборки ресничек усиливает рост кисты в моделях ADPKD у мышей (Nikonova et al. al, 2014). Наши данные указывают на вызванную сывороткой децилизацию как клеточный процесс, на который влияет потеря полицистинов.

Мы предполагаем, что путь CI / MS является важным промежуточным звеном между потерей полицистинов и снижением скорости индуцированной сывороткой децилиляции. Этот вывод основан на следующих доказательствах. Во-первых, клетки, лишенные Pkd1 или Pkd2 , не обнаруживают различий в уровнях ресничек или длине ресничек при голодании сыворотки, указывая тем самым, что потеря PKD1 или PKD2 не влияет на программы сборки ресничек. Напротив, клетки, лишенные Pkd1 или Pkd2 , демонстрируют пониженную скорость индуцированной сывороткой децилиляции, которая устраняется нокдацией или ингибированием компонентов пути CI / MS, таких как USP28, 53BP1 и p53.Напротив, сверхэкспрессия этих факторов в клетках дикого типа вызывает отсроченную децилиацию, указывая на то, что активация пути CI / MS происходит ниже по течению потери полицистина и выше по течению от отсроченной разборки. Во-вторых, почечные клетки, выстилающие кистозный эпителий в моделях мышей с ADPKD, показывают не только большее количество EdU-положительных клеток, но также большее количество EdU-положительных клеток с первичными ресничками, чем клетки дикого типа, что позволяет предположить, что децилиация клеток нарушена. тем не менее, вход в S активируется в мутантных клетках.Это указывает на возможное разъединение тесной координации децилиации и прогрессии клеточного цикла. В-третьих, сверхэкспрессия NDE1 во время разборки вызывает децилиацию в мутантных клетках, но не в клетках дикого типа. Это открытие указывает на то, что NDE1 оказывает негативное влияние на биогенез и поддержание ресничек, но не на реснички, подвергающиеся разборке или отслаиванию, несмотря на тот факт, что он был идентифицирован как компонент CDC (Gabriel et al, 2016). Важный вопрос заключается в том, как активация p53 приводит к снижению уровня экспрессии белка NDE1.Поскольку p53 опосредует свои эффекты посредством активации транскрипции, мы полагаем, что влияние p53 на NDE1 является непрямым, возможно, через индукцию транскрипции фактора (ов), которые подавляют NDE1 и дополнительные факторы децилирования. Эти данные привели нас к предложению модели, в которой делеция полицистинов активирует путь CI / MS за счет увеличения уровней / активности USP28, 53BP1 и p53. Активация этого пути приостанавливает индуцированную сывороткой децилизацию, обеспечивая стойкую активацию цилиарных сигнальных путей.Эти пути могут включать TGF-β / Smad, Hedgehog, канонический Wnt / β-catenin и другие, которые могут способствовать росту кисты линейным и / или параллельным путями ().

Предложенный механизм, с помощью которого истощение PKD1 / PKD2 ведет к усилению передачи сигналов, связанных с ресничками.

Истощение PKD1 или PKD2 индуцирует центросомную целостность / путь митотического наблюдения, что приводит к уменьшению разборки ресничек и / или скорости шедирования (децилирования). Снижение скорости децилирования продлевает активацию зависимых от ресничек сигнальных путей (т.е.е., TGFβ / Smad, Hedgehog и Wnt / βcatenin).

Наши данные, однако, подтверждают не прямое влияние потери полицистинов на вызванную сывороткой децилиляцию, а скорее косвенный эффект через активацию пути CI / MS. Мы показываем, что делеция или фармакологическое ингибирование p53, 53BP1 или USP28 восстанавливает скорость децилирования в клетках, лишенных Pkd1 . Эти данные подтверждают, что эти белки функционируют после потери Pkd1 при дециляции. Мы пока не знаем, как именно потеря Pkd1 или Pkd2 активирует путь CI / MS.Поскольку этот путь может быть активирован потерей центросомы, задержкой митоза или обоими способами, и в этом случае потеря центросомы вызывает задержку митоза (Lambrus & Holland, 2017), возможно, что одной из нормальных функций полицистинов может быть поддержание CI. Однако мы не наблюдаем центросомной потери, грубых центросомных аномалий, таких как фрагментация или амплификация в Pkd1 – или Pkd2 -нульных клетках, несмотря на предыдущие сообщения о центросомной амплификации в Pkd1 – или Pkd2 -null MEF. и почки (Battini et al, 2008; Burtey et al, 2008).Следует отметить, что даже если центросомная амплификация происходит в Pkd1 -null NIh4T3 клетках выше их известных уровней в 6% (Wong et al, 2015), путь CI / MS должен активироваться не центросомной амплификацией, а скорее центросомной потерей. . Мы поддерживаем идею о том, что полицистины дикого типа могут играть важную роль в поддержании CI, и их потеря вызывает тонкие структурные изменения даже до того, как клетки будут индуцированы для вступления в клеточный цикл, потому что уровни мРНК 53bp1 и Usp28 были повышены в сыворотке -голодные клетки.Поскольку центросома является безмембранной органеллой, маловероятно, что комплекс PKD1 / PKD2 физически участвует в CI. Однако PKD1 / PKD2-обеспечиваемая передача сигналов Ca ²⁺ может влиять на критические аспекты биогенеза, созревания и поддержания центросом. В поддержку этой гипотезы, мутантные формы PKD1 или PKD2, которые нарушают активность канала, не смогли устранить дефекты дециляции в мутантных клетках Pkd1 – или Pkd2 , что указывает на то, что присутствие функционального комплекса полицистина необходимо для CI / нормального децилирования.В будущем потребуется дополнительная работа, чтобы определить механизм, с помощью которого потеря полицистина запускает путь CI / MS.

Наши данные показывают, что процент мерцательных клеток или длина ресничек не изменяется в клетках с недостатком сыворотки, лишенных Pkd1 или Pkd2 и клеток дикого типа. Следовательно, у нас нет доказательств того, что потеря полицистинов влияет на программы сборки ресничек. Это согласуется с данными наших мышей, в которых длина ресничек, по-видимому, не сильно отличается между клетками дикого типа и мутантными клетками, если только клетки не активно циклируют, как это определено с помощью мечения EdU.Можно утверждать, что 24-часовой импульс EdU может маркировать клетки во всех фазах клеточного цикла, включая G1. Однако на P21 пролиферация клеток в почках чрезвычайно низка, как было показано ранее, что 3-часовой импульс BrdU на P24 метил только 4% кистозных клеток и 0% клеток дикого типа (Shibazaki et al, 2008). Следовательно, вероятность того, что EdU-положительная клетка окажется в фазе G1 после прохождения фаз S, G2 и M, довольно мала. Более того, клетка, которая перешла от S к G1 в течение 24 часов, должна продуцировать две дочерние клетки, меченные EdU, локализованные рядом друг с другом, чего мы не видим.Следовательно, мы поддерживаем идею, что EdU-положительные клетки представляют клетки в основном в S-фазе и в меньшей степени в G2. Это подтверждается нашими данными по идентификации GEMININ-позитивных клеток с ресничками в мутантных почках, но не в почках дикого типа. Основываясь на окрашивании DAPI, мы не видим много делящихся клеток, а на основании окрашивания γ-h3AX мы пришли к выводу, что клетки, подвергающиеся повреждению ДНК или испытывающие геномную нестабильность, едва обнаруживаются ни в почках дикого типа, ни в мутантных почках. Следовательно, мы предполагаем, что кистозные клетки перешли в фазу S с частично резорбированными ресничками или интактными ресничками.Сначала эта гипотеза может показаться противоречащей общей повышенной пролиферации клеток в кистозных почках. Однако может быть несколько объяснений, заслуживающих дальнейшего рассмотрения. Мы и другие авторы предположили, что ускоренная разборка или укорочение / потеря ресничек может ускорить повторный вход в клеточный цикл, тогда как отсроченная разборка или аномально длинные реснички могут иметь противоположные эффекты (Pan & Snell, 2007; Kim & Tsiokas, 2011; Sung & Li, 2011; Ван и Динлахт, 2018). Эти данные предполагают, что первичные реснички могут функционировать как физическая контрольная точка прогрессии клеточного цикла.Несколько противоречит этой идее, однако, тот факт, что первичные реснички содержат многочисленные сигнальные пути, большинство из которых обладают сильными митогенными эффектами (Schneider et al, 2005; Christensen et al, 2012; Yeh et al, 2013). Кроме того, реснички могут способствовать или подавлять зависимый от передачи сигналов Hedgehog туморогенез в зависимости от мутации драйвера (Han et al, 2009; Wong et al, 2009). Наконец, реснички придают химиорезистентность определенным типам опухолей (Jenks et al, 2018). Следовательно, кажется, что первичные реснички могут иметь как положительные, так и отрицательные эффекты на развитие клеточного цикла.Хотя они необходимы для инициации митогенной передачи сигналов, они также должны своевременно разбираться или сбрасываться для нормального развития клеточного цикла. Предполагая, что отсроченная разборка не вызывает полной остановки клеток, это может поддерживать постоянную передачу митогенных сигналов на основе ресничек в некотором количестве клеток, которые, возможно, стохастически, обычно не входят в клеточный цикл. Это дополнительное время, в течение которого клетки подвергаются митогенному стимулу, может привести к тому, что в конечном итоге в клеточный цикл войдет больше клеток, увеличивая количество пролиферирующих клеток.Тем не менее, может ли и как отсроченная децилиация способствовать повторному входу в клеточный цикл в условиях ADPKD, требует дальнейшего изучения.

В целом, наши исследования выдвинули новую модель, в которой физиологическая клеточная функция полицистинов заключается в поддержании КИ. Утрата этой функции активирует путь CI / MS, который, в свою очередь, сигнализирует клеткам о замедлении скорости децилирования. В результате передача сигналов на основе ресничек может сохраняться, способствуя кистозному росту (2). Молекулярная идентичность базирующегося на ресничках сигнального пути (ов) с активностью, способствующей развитию цист, все еще остается невыясненной, но это могут быть пути, которые опосредуют передачу митогенных сигналов.Постоянная активация митогенной передачи сигналов на основе ресничек может рекрутировать почечные эпителиальные клетки в G1 / G0, чтобы в конечном итоге войти в клеточный цикл, способствуя разрастанию и росту кист.

Материалы и методы

Культура клеток

Pkd1 ^{+ / +} (дикий тип) и Pkd1 ^{– / –} MEF были получены из Балтиморского центра PKD. Pkd2 ^{+ / +} и Pkd2 ^{– / –} клетки внутреннего мозгового протока мыши (mIMCD3) были любезным подарком от лаборатории Клини (Университет Цинциннати).Клетки NIh4T3 получали из Американской коллекции типовых культур. MEF поддерживали в DMEM (4,5 г / л глюкозы, L-глутамина и пирувата натрия) с добавлением 1% пенициллина-стрептомицина, 1% заменимых аминокислот и 10% FBS. Клетки mIMCD3 культивировали в смеси 1: 1 DMEM и Ham’s F-12 с добавлением 10% FBS. Клетки NIh4T3 поддерживали в среде DMEM, содержащей 10% бычью телячью сыворотку.

Реагенты

Параформальдегид (Каталожный номер J19943-K2), EdU (Каталожный номер {“тип”: “энтрез-нуклеотид”, “attrs”: {“text”: “C10337”, “term_id”: «1535408», «term_text»: «C10337»}} C10337), длительный алмазный DAPI (кат.нет. {“type”: “entrez-protein”, “attrs”: {“text”: “P36966”, “term_id”: “51704274”, “term_text”: “P36966”}} P36966), Trizol (№ кат. 15596018) и реагент LTX (каталожный номер 15338100) были приобретены у Thermo Fisher Scientific. Нутлин-3 (каталожный номер 3984) и пифитрин-α гидробромид (каталожный номер 1267) были приобретены у Tocris. 4-гидрокситамоксифен был приобретен у Sigma-Aldrich (каталожный номер H6278).

Редактирование гена CRISPR – CAS9

Для генерации NIh4T3 ^Pkd1-KO и NIh4T3 ^{Pkd2-KO с помощью вектора pkd2-KO , кодирующего клоны} , клетки NIh4-T были трансфицированы (клетки NIh4-T2 были трансфицированы с помощью антивирусного вектора pnIH4T2, клетки NIh4T были трансфицированы) Cas9, устойчивость к пуромицину и последовательности одиночной направляющей РНК (sgRNA), специфичные для Pkd1 (5′-AGGGCCGAGTCTGCGCATCC-3 ‘) или Pkd2 (5′-AAGTGCTGAAGTCATCGACC-3′).После трансфекции клетки подвергали серийным разведениям и высевали с выделением пуромицина (1 мкг / мл) в течение 3 недель. После отбора отдельные колонии были изолированы и размножены. Полученные клоны оценивали на предмет делеции интересующих генов с помощью секвенирования ДНК по Сэнгеру и вестерн-блоттинга.

Иммунопреципитация

Лизаты клеток NIh4T3 дикого типа или Pkd1 -null инкубировали с двумя антителами против α-PKD1 (7e12; Santa Cruz and E4; PKD Baltimore Center) в течение ночи для иммунопреципитации PKD1.Комплексы антиген-антитело затем инкубировали с шариками протеин G-сефарозы в течение 3 часов при 4 ° C. Иммунопреципитаты анализировали на присутствие PKD1 с помощью вестерн-блоттинга.

Непрямая иммунофлуоресценция на культивируемых клетках

Клетки первоначально высевали на стеклянные покровные стекла с плотностью ~ 30 000 клеток / лунку в 24-луночные планшеты. Чтобы вызвать синхронизацию образования G1 / G0 и первичных ресничек, клетки частично или полностью лишали сыворотки в течение 48 часов. В частности, MEF культивировали в среде с низким содержанием сыворотки OptiMEM, клетки mIMCD3 культивировали в среде DMEM / F12, содержащей 0.Клетки 5% FBS и NIh4T3 содержали в среде DMEM без сыворотки. Для индукции децилитации клетки рестимулировали их соответствующей средой для полного роста (описанной выше). После рестимуляции сыворотки клетки фиксировали 4% параформальдегидом в PBS, pH 7,5, в различные моменты времени. Визуализацию первичных ресничек выполняли, как описано ранее (Maskey et al, 2015). Вкратце, фиксированные клетки пермеабилизировали 0,15% Triton X-100 в PBS в течение 90 с и блокировали 3% козьей сывороткой / 0.15% Triton X-100 в PBS в течение 1 часа. Затем фиксированные клетки инкубировали в течение ночи при 4 ° C с первичными антителами, детектирующими Arl13b (1: 500; Proteintech), γ-тубулин (1: 500; Invitrogen), γ-h3AX (1: 200; Cell Signaling), USP28 ( 1: 100; Proteintech) и 53BP1 (1: 1000; Novus Biologicals). Затем клетки промывали 3 раза PBS и инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с Alexa Fluor (1: 2,000; Invitrogen), в течение 2 часов при 4 ° C в защищенном от света месте. Затем образцы промывали 3 раза PBS и устанавливали с помощью Diamond DAPI (Thermo Fisher Scientific) для контрастирования ядер.Изображения были получены с помощью конфокального микроскопа Olympus FV1000 и обработаны с помощью программного обеспечения ImageJ для измерения длины ресничек.

Эксперименты по спасению и siRNA

Для экспериментов по спасению децилиляции клетки NIh4T3 дикого типа или мутантные клетки NIh4T3 котрансфицировали с использованием LTX (Invitrogen) плазмидой, экспрессирующей GFP, и одной из следующих плазмид, экспрессирующих а) пустой вектор, b ) PKD1 человека, c) PKD1 ^S99I d) PKD2 человека, e) PKD2 ^D511V , или f) PKD2 ^Y684del .Затем клетки подвергались синхронизации за счет сывороточного голодания и индуцировались децилизацией и повторным входом в клеточный цикл с помощью сыворотки. GFP-положительные клетки оценивали на наличие первичных ресничек. p53 был нацелен с использованием плазмиды, экспрессирующей единственную направляющую РНК, нацеленную на мышиный p53 (Addgene) в клетках дикого типа или мутантных клетках NIh4T3. Эксперименты по нокдауну Usp28 и 53bp1 проводили с использованием SMARTpool: ON-TARGETplus Usp28 siRNA (Dharmacon, каталожный номер L-065548-01-0005) и SMARTpool: ON-TARGETplus 53bp1 9020 .нет. L-042290-01-0005) соответственно. Клетки котрансфицировали, используя LTX, GFP и любой из конструкций siRNA и анализировали на наличие первичных ресничек после индуцированной сывороткой децилиации. Плазмиды экспрессии, несущие кДНК USP28, 53BP1 или p53, котрансфицировали с GFP в клетки NIh4T3 дикого типа с использованием LTX, и GFP-положительные клетки оценивали на наличие первичных ресничек после индукции сывороткой.

Обработка мышей и ткани почек

Все процедуры были выполнены в соответствии с требованиями Институционального комитета по уходу и использованию животных.В этом исследовании использовались три типа мышей C57Bl / 6-фона: a) Pkd1 ^{f / f} , в качестве однопометников дикого типа, b) UbcCre ^ERT2 ; Pkd1 f / f , и c) KspCre ^ERT2 ; Pkd1 ^{f / f} . Для делеции Pkd1 кормящим мамам внутрибрюшинно вводили 4-гидрокситамоксифен (4-OHT; Sigma-Aldrich), разведенный в кукурузном масле, в дозе 100 мкг на грамм веса тела мыши, со 2-6 дней постнатального развития (P2– P6).За 1 день до эвтаназии детенышам внутрибрюшинно вводили EdU в PBS (20 мкг EdU на грамм веса тела мыши) и умерщвляли через 24 часа. Перед умерщвлением измеряли общую массу тела мышей. У каждой мыши извлекали почки и взвешивали. Одну из почек быстро замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° C. Замороженные почки позже лизировали и фракционировали на ядерную и цитозольную фракции с использованием набора для экстракции цитоплазматических и ядерных белков (кат.P504L; 101Bio). Другая почка была разделена пополам, сохранена в 4% PFA в PBS в течение ночи, затем в 10% сахарозе в PBS в течение ночи, помещена на криогенные подставки с замороженным соединением срезов (Leica) в течение 30 минут, а затем быстро заморожена на сухом льду и хранится −80 ° С. Замороженные срезы почек толщиной 10 мкм были приготовлены в Центре медицинских наук Университета Оклахомы (OUHSC) Stephenson Cancer Center Histology Core и были использованы для непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания.

Непрямая иммунофлуоресценция на образцах ткани почек

Все эксперименты проводили с использованием системы окрашивания Thermo Scientific Sequenza (кат.нет. 73310017) на основе протокола, любезно предоставленного доктором Пазуром (Массачусетс, Массачусетс). Вкратце, замороженные срезы почек первоначально инкубировали в бане с трис-буфером и физиологическим раствором с твином (TBST) в течение 5 минут для удаления замороженного соединения срезов, а затем помещали на закрывающие планшеты (каталожный номер 7211017; Thermo Fisher Scientific) и инкубировали с блокировкой. буфер (4% неиммунная козья сыворотка / 0,1% желатин из кожи холодноводной рыбы / 0,1% Triton X-100 в TBST) в течение 30 мин. Затем EdU-положительные клетки визуализировали в соответствии с инструкциями производителя.Если желательно окрашивание почечного сегмента, эндогенный биотин блокировали с помощью набора для блокировки стрептавидина / биотина (Vector). После трехкратной промывки TBST эндогенный мышиный IgG блокировали Fab-антителом-хозяином в течение 2 часов (разведение 1:10 в 0,1% желатине рыбьей кожи в TBST; Jackson Immunoresearch). Затем срезы инкубировали с первичным антителом против ацетилированного α-тубулина (611b, 1: 5 000; Sigma-Aldrich), γ-h3AX (1: 200; Cell Signaling) или GEMININ (1: 100; Proteintech) в течение ночи при 4 час. ° C (разбавленный 0.1% желатина рыбьей кожи в TBST). Для визуализации сегментов почек образцы инкубировали с биотинилированным агглютинином Dolichos Biflorus (вектор) для маркировки собирающих протоков или с биотинилированным лектином Lotus Tetragonolobus (вектор) для маркировки проксимальных канальцев. После 5-кратной отмывки в TBST срезы инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с Alexa Fluor (1: 1000), в течение 1 ч в RT, защищенной от света, промывали 5-кратно TBST, инкубировали в бане TBST в течение 15 минут, а затем в Ванна TBS на 15 мин. Наконец, срезы были закреплены с помощью Diamond DAPI и визуализированы с помощью конфокальной микроскопии.

Иммуноблоттинг

Лизаты клеток получали в растворе для лизиса, содержащем 1% Тритон X-100, 150 мМ NaCl, 10 мМ Трис-HCl при pH 7,5, 1 мМ EGTA, 1 мМ EDTA, 10% сахарозу, коктейль ингибиторов протеаз. (Roche Applied Science) и ингибиторы фосфатазы 0,2 мМ Na ₃ VO ₄ и 1 мМ NaF при 4 ° C в течение 30 мин. Лизаты клеток или тканей разделяли с помощью SDS-PAGE. Антитела использовали против p-Smad2 465/467 (1: 1000; Cell Signaling), GAPDH (1: 4000; Genetex), p53 (1: 1,000; Cell Signaling или 1: 500; Millipore), Disheveled-2 (1: 1000; Cell Signaling), INPP5E (1: 1000; Proteintech), NDE1 (1: 1000; Proteintech), USP28 (1: 1000; Proteintech), 53BP1 (1: 1000; Novus Biologicals), β-тубулин (1: 1000. ; Санта-Крус), β-актин (1: 1000; Санта-Крус) PKD1 (E8, 1: 1000; PKD Baltimore Center) и PKD2 (G-20, 1: 1000; Санта-Крус).Денситометрический количественный анализ проводили с помощью программного обеспечения Licor Image Studio.

Скрининг сигнальных путей

Активность 45 различных клеточных сигнальных путей измеряли в соответствии с инструкциями производителя (каталожный номер CCA-901L-12; Qiagen). Вкратце, клетки mIMCD3 дикого типа и Pkd1, – или Pkd2, -нулевые клетки NIh4T3 или клетки mIMCD3 дикого типа и -Pkd2, -нулевые клетки высевали для обратной трансфекции в 96-луночный планшет, содержащий иммобилизованные репортерные плазмиды.Каждая пара лунок содержала плазмиды, экспрессирующие люциферазу светлячка в зависимости от активности конкретного клеточного пути. Каждая лунка также содержала плазмиду, которая конститутивно экспрессировала люциферазу Renilla, чтобы учесть различия в эффективности трансфекции. Обратная трансфекция опосредована аттрактеном (№ по каталогу 301005; Qiagen). Полную среду роста заменяли через 24 часа после трансфекции, и клетки лизировали в буфере для лизиса (каталожный номер E194A; Promega) через 48 часов после трансфекции. Лизаты клеток инкубировали с субстратами Stop & Glo (Dual-Luciferase Reporter Assay System, Cat.нет. E1960; Promega), а активность люциферазы измеряли в Synergy Neo2 Reader (Biotek). Все значения люциферазы светлячков были нормализованы к значениям люциферазы Renilla, а затем значения всех мутантных образцов были нормализованы к дикому типу.

Количественная ОТ-ПЦР (qRT-PCR)

РНК

экстрагировали и очищали из клеток NIh4T3 дикого типа или -нулевых Pkd1 -нулевых клеток в различные моменты времени после рестимуляции сыворотки с использованием реагента TRIzol (Thermo Fisher Scientific). РНК подвергали обратной транскрипции в кДНК, и образцы амплифицировали с помощью кПЦР.Уровни мРНК интересующих генов были нормализованы к дикому типу через 0 ч с помощью метода ΔΔCt. Праймеры, использованные для кПЦР, были Usp28 Fw: 5′-AGTTGGGCTGAAAAATGTTGGC-3 ‘, Usp28 Rv: 5′-TCAAGGATGTTCTGTGGCAGG-3′, 53TTCTGTGGCAGG-3 ‘, 53TTCvTC’: 5AGGCC1 FwGCC1 FwGCC2 ′ -TGATGGTTCTTCCAGAC TTGGT-3 ′, Tbp Fw: 5′-TCTACCGTGAATCTTGGCTGT-3 ′ и Tbp Rv: 5′-GTCCGTGGCTCTCTTATTCTCA-3 ′.

Статистика

Программное обеспечение GraphPad Prism 8.3 использовался для всех статистических анализов, описанных в тексте. Количественные результаты, которые требовали сравнения между группами, подвергали статистическому анализу с использованием теста t для двух групп или одно- или двустороннего дисперсионного анализа с последующим соответствующим специальным тестом.

Благодарности

Мы благодарим докторов наук. S Kleene за предоставление клеток IMCD3 без PKD2, G Pazour и M. Hinsdale за предоставление протоколов иммунофлуоресцентного мечения тканей и W Berry за советы по экспериментам с CRISPR / Cas9.Мы благодарим Центр гистологии и иммуногистохимии Центра медицинских наук Университета Оклахомы (OUHSC) Онкологического центра Стивенсона за гистологию и срезы тканей при поддержке P30CA225520 и P20GM103639. Эта работа была поддержана DK59599 и DK117654 (Национальные институты здравоохранения) и пресвитерианским фондом здоровья и кафедрой поликистозной болезни почек Джона С. Гэммилла (Центр медицинских наук Университета Оклахомы) Л. Циокасу. В. Геракопулос был поддержан докторской стипендией Американского общества нефрологов.

Вклад авторов

• V Gerakopoulos: концептуализация, обработка данных, формальный анализ, привлечение финансирования, исследование и написание – первоначальный черновик, рецензирование и редактирование.

• P Ngo: методология.

• L Tsiokas: концептуализация, обработка данных, надзор, получение финансирования, расследование, администрирование проекта и написание – первоначальный черновик, рецензирование и редактирование.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Ссылки

• Battini L, Macip S, Fedorova E, Dikman S, Somlo S, Montagna C, Gusella GL (2008) Потеря полицистина-1 вызывает амплификацию центросом и геномную нестабильность. Хум Мол Генет
  17: 2819–2833. 10.1093 / hmg / ddn180 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Benzakour O, Merzak A, Dooghe Y, Pironin M, Lawrence D, Vigier P (1992) Трансформирующий бета-фактор роста стимулирует митогенно мышиный NIh4T3 фибробласты и клетки, трансформированные онкогеном EJ-H ras.Факторы роста
  6: 265–275. 10.3109 / 089771992033 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Bhunia AK, Piontek K, Boletta A, Liu L, Qian F, Xu PN, Germino FJ, Germino GG (2002) PKD1 индуцирует p21 (waf1) и регуляцию клеточный цикл через прямую активацию сигнального пути JAK-STAT в процессе, требующем PKD2. Клетка
  109: 157–168. 10.1016 / s0092-8674 (02) 00716-x [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Bielas SL, Silhavy JL, Brancati F, Kisseleva MV, Al-Gazali L., Sztriha L, Bayoumi RA, Zaki MS, Abdel -Aleem A, Rosti RO, et al.(2009) Мутации в INPP5E, кодирующем инозитолполифосфат-5-фосфатазу Е, связывают передачу сигналов фосфатидилинозитола с цилиопатиями. Нат Жене
  41: 1032–1036. 10.1038 / ng.423 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Breslow DK, Holland AJ (2019) Механизм и регуляция биогенеза центриолей и ресничек. Анну Рев Биохим
  88: 691–724. 10.1146 / annurev-biochem-013118-111153 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Burtey S, Riera M, Ribe E, Pennenkamp P, Rance R, Luciani J, Dworniczak B, Mattei MG, Fontes M (2008) Сверхдупликация центросом и митотическая нестабильность в трансгенных линиях PKD2.Cell Biol Int
  32: 1193–1198. 10.1016 / j.cellbi.2008.07.021 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Chaki M, Airik R, Ghosh AK, Giles RH, Chen R, Slaats GG, Wang H, Hurd TW, Zhou W, Cluckey A. , и другие. (2012) Захват экзома выявляет мутации ZNF423 и CEP164, связывающие почечные цилиопатии с передачей сигналов ответа на повреждение ДНК. Клетка
  150: 533–548. 10.1016 / j.cell.2012.06.028 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Christensen ST, Clement CA, Satir P, Pedersen LB (2012) Первичные реснички и координация рецепторной тирозинкиназы (RTK ) сигнализация.Джей Патол
  226: 172–184. 10.1002 / path.3004 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Clement CA, Ajbro KD, Koefoed K, Vestergaard ML, Veland IR, Henriques de Jesus MP, Pedersen LB, Benmerah A, Andersen CY , Ларсен Л.А. и др. (2013) Передача сигналов TGF-beta связана с эндоцитозом в области кармана первичной реснички. Сотовый представитель
  3: 1806–1814. 10.1016 / j.celrep.2013.05.020 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Давенпорт Дж. Р., Уоттс А. Дж., Ропер В. К., Кройл М. Дж., Ван Гроен Т., Висс Дж. М., Надь Т. Р., Кестерсон Р. А., Йодер Б. К. (2007 г. ) Нарушение внутрижгутикового транспорта у взрослых мышей приводит к ожирению и медленно развивающейся кистозной болезни почек.Curr Biol
  17: 1586–1594. 10.1016 / j.cub.2007.08.034 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Fong CS, Mazo G, Das T, Goodman J, Kim M, O’Rourke BP, Izquierdo D, Tsou MF (2016) 53BP1 и USP28 опосредуют p53-зависимую остановку клеточного цикла в ответ на потерю центросом и длительный митоз. Элиф
  5: e16270
  10.7554 / elife.16270 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Габриэль Е., Васон А., Рамани А., Гуи Л. М., Келлер П., Позняковский А., Позер И., Ноак Ф., телугу Н. С., Калегари F, et al.(2016) CPAP способствует своевременной разборке ресничек для поддержания пула нейральных предшественников. EMBO J
  35: 803–819. 10.15252 / embj.201593679 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Haimo LT, Rosenbaum JL (1981) Реснички, жгутики и микротрубочки. J Cell Biol
  91: 125с – 130с. 10.1083 / jcb.91.3.125s [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Han YG, Kim HJ, Dlugosz AA, Ellison DW, Gilbertson RJ, Alvarez-Buylla A (2009) Двойные и противоположные роли первичных ресничек в развитии медуллобластомы.Нат Мед
  15: 1062–1065. 10.1038 / нм.2020 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Hassane S, Leonhard WN, van der Wal A, Hawinkels LJ, Lantinga-van Leeuwen IS, ten Dijke P, Breuning MH, de Heer E, Peters DJ (2010) Повышенная передача сигналов TGFbeta-Smad в экспериментальных моделях Pkd1 и у людей с поликистозом почек. Джей Патол
  222: 21–31. 10.1002 / path.2734 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Hopp K, Ward CJ, Hommerding CJ, Nasr SH, Tuan HF, Gainullin VG, Rossetti S, Torres VE, Harris PC (2012) Функциональный полицистин-1 от дозы зависит степень тяжести аутосомно-доминантного поликистоза почек.J Clin Invest
  122: 4257–4273. 10.1172 / jci64313 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Ishikawa H, Marshall WF (2011) Цилиогенез: построение антенны клетки. Нат Рев Мол Cell Biol
  12: 222–234. 10.1038 / nrm3085 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Дженкс А.Д., Вайс С., Вонг Дж. П., Костарас Э., Келлер Д., Бургойн Т., Шумарк А., Цаликис А., де ла Рош М., Михаэлис М. и др. (2018) Первичные реснички опосредуют различные механизмы устойчивости к ингибиторам киназ при раке. Сотовый представитель
  23: 3042–3055.10.1016 / j.celrep.2018.05.016 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Johnson CA, Collis SJ (2016) Цилиогенез и реакция на повреждение ДНК: стрессовые отношения. Реснички
  5: 19
  10.1186 / s13630-016-0040-6 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Kim H, Bae Y, Jeong W, Ahn C, Kang S (2004) Истощение PKD1 антисмысловым олигодезоксинуклеотидом вызывает преждевременный переход G1 / S-фазы. Eur J Hum Genet
  12: 433–440. 10.1038 / sj.ejhg.5201136 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Kim S, Lee K, Choi JH, Ringstad N, Dynlacht BD (2015) Активация Kif24 Nek2 обеспечивает разборку ресничек во время клеточного цикла.Nat Commun
  6: 8087
  10.1038 / ncomms9087 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Kim S, Nie H, Nesin V, Tran U, Outea P, Bai CX, Keeling J, Maskey D, Watnick T, Wessely O, и другие. (2016) Комплекс полицистина обеспечивает передачу сигналов Wnt / Ca (2+). Nat Cell Biol
  18: 752–764. 10.1038 / ncb3363 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Ким С., Циокас Л. (2011) Реснички и возвращение в клеточный цикл: больше, чем совпадение. Клеточный цикл
  10: 2683–2690. 10.4161 / cc.10.16.17009 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Kim S, Zaghloul NA, Bubenshchikova E, Oh EC, Rankin S, Katsanis N, Obara T, Tsiokas L (2011) Nde1-опосредованное подавление цилиогенеза влияет на повторный вход в клеточный цикл. Nat Cell Biol
  13: 351–360. 10.1038 / ncb2183 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Kleene SJ, Kleene NK (2016) Нативный TRPP2-зависимый канал первичных ресничек почек мыши. Am J Physiol Renal Physiol
  312: F96 – F108. 10.1152 / айпренал.00272.2016 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Kobayashi T, Dynlacht BD (2011) Регулирование перехода от центриоли к базальному телу. J Cell Biol
  193: 435–444. 10.1083 / jcb.201101005 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Koulen P, Cai Y, Geng L, Maeda Y, Nishimura S, Witzgall R, Ehrlich BE, Somlo S (2002) Polycystin- 2 – внутриклеточный канал высвобождения кальция. Nat Cell Biol
  4: 191–197. 10.1038 / ncb754 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Lambrus BG, Daggubati V, Uetake Y, Scott PM, Clutario KM, Sluder G, Holland AJ (2016) Сигнальная ось USP28-53BP1-p53-p21 останавливает рост после потери центросомы или длительного митоза.J Cell Biol
  214: 143–153. 10.1083 / jcb.201604054 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Lambrus BG, Holland AJ (2017) Новый режим митотического наблюдения. Тенденции Cell Biol
  27: 314–321. 10.1016 / j.tcb.2017.01.004 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Lee KH, Johmura Y, Yu LR, Park JE, Gao Y, Bang JK, Zhou M, Veenstra TD, Yeon Kim B, Lee KS (2012) Идентификация нового пути разборки первичных ресничек, опосредованного Wnt5a-CK1varepsilon-Dvl2-Plk1.EMBO J
  31: 3104–3117. 10.1038 / emboj.2012.144 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Leonhard WN, Kunnen SJ, Plugge AJ, Pasternack A, Jianu SB, Veraar K, El Bouazzaoui F, Hoogaars WM, Ten Dijke P , Breuning MH, et al. (2016) Ингибирование передачи сигналов активина замедляет прогрессирование поликистоза почек. J Am Soc Nephrol
  27: 3589–3599. 10.1681 / asn.2015030287 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Li A, Saito M, Chuang JZ, Tseng YY, Dedesma C, Tomizawa K, Kaitsuka T, Sung CH (2011) Цилиарный переход зона активации фосфорилированного Tctex-1 контролирует резорбцию ресничек, вступление в S-фазу и судьбу нейральных предшественников.Nat Cell Biol
  13: 402–411. 10.1038 / ncb2218 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Li X, Luo Y, Starremans PG, McNamara CA, Pei Y, Zhou J (2005) Полицистин-1 и полицистин-2 регулируют клетку цикл через ингибитор спираль-петля-спираль Id2. Nat Cell Biol
  7: 1102–1112. 10.1038 / ncb1326 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Лю Х., Киселева А.А., Големис Е.А. (2018) Цилиарная передача сигналов при раке. Нат Рев Рак
  18: 511–524. 10.1038 / s41568-018-0023-6 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Low SH, Vasanth S, Larson CH, Mukherjee S, Sharma N, Kinter MT, Kane ME, Obara T, Weimbs T (2006). Полицистин-1, STAT6 и P100 действуют по пути, который трансдуцирует механочувствительность ресничек и активируется при поликистозе почек.Dev Cell
  10: 57–69. 10.1016 / j.devcel.2005.12.005 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Ma M, Tian X, Igarashi P, Pazour GJ, Somlo S (2013) Потеря ресничек подавляет рост кисты в генетических моделях аутосомно-доминантного поликистоз почек. Нат Жене
  45: 1004–1012. 10.1038 / ng.2715 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Maskey D, Marlin MC, Kim S, Kim S, Ong EC, Li G, Tsiokas L (2015) Убиквитилирование в зависимости от клеточного цикла а разрушение NDE1 с помощью CDK5-FBW7 регулирует длину ресничек.EMBO J
  34: 2424–2440. 10.15252 / embj.2014 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• McGarry TJ, Kirschner MW (1998) Геминин, ингибитор репликации ДНК, разрушается во время митоза. Клетка
  93: 1043–1053. 10.1016 / s0092-8674 (00) 81209-x [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Meitinger F, Anzola JV, Kaulich M, Richardson A, Stender JD, Benner C, Glass CK, Dowdy SF, Desai A, Shiau AK, et al. (2016) 53BP1 и USP28 опосредуют активацию p53 и остановку G1 после потери центросомы или увеличения продолжительности митоза.J Cell Biol
  214: 155–166. 10.1083 / jcb.201604081 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Мирвис М., Симерс К.А., Нельсон В.Дж., Стернс Т.П. (2019) Первичная потеря ресничек в клетках млекопитающих происходит преимущественно за счет выделения целых ресничек. PLoS Biol
  17: e3000381
  10.1371 / journal.pbio.3000381 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Мирвис М., Стернс Т., Джеймс Нельсон В. (2018) Структура, сборка и разборка ресничек регулируются цитоскелетом. Biochem J
  475: 2329–2353.10.1042 / bcj20170453 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Miyamoto T., Hosoba K, Ochiai H, Royba E, Izumi H, Sakuma T, Yamamoto T, Dynlacht BD, Matsuura S (2015) Деполимеризующая активность микротрубочек митотического кинезинового белка KIF2A запускает разборку первичных ресничек, связанную с пролиферацией клеток. Сотовый представитель
  10: 664–673. 10.1016 / j.celrep.2015.01.003 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Nauli SM, Alenghat FJ, Luo Y, Williams E, Vassilev P, Li X, Elia AE, Lu W, Браун Э.М., Куинн С.Дж. и др.(2003) Полицистины 1 и 2 опосредуют механочувствительность в первичных ресничках почечных клеток. Нат Жене
  33: 129–137. 10.1038 / ng1076 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Nigg EA, Stearns T (2011) Цикл центросом: биогенез центриолей, дупликация и присущие асимметрии. Nat Cell Biol
  13: 1154–1160. 10.1038 / ncb2345 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Никонова А.С., Асцатуров И.Г., Серебряский И.Г., Данбрак Р.Л. мл., Големис Е.А. (2013) Киназа Aurora A (AURKA) в нормальном и патологическом делении клеток .Cell Mol Life Sci
  70: 661–687. 10.1007 / s00018-012-1073-7 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Никонова А.С., Денека А.Ю., Киселева А.А., Коробейников В., Гапонова А., Серебряский И.Г., Копп М.С., Хенсли Х.Х., Seeger-Nukpezah TN, Somlo S, et al. (2018) Ганетеспиб ограничивает образование ресничек и цистогенез при аутосомно-доминантной поликистозной болезни почек (ADPKD). FASEB J
  32: 2735–2746. 10.1096 / fj.201700909R [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Никонова А.С., Плотникова О.В., Сержанова В., Ефимов А., Богуш И., Цай К.К., Хенсли Х.Х., Эглстон Б.Л., Кляйн-Сзанто А. , Сигер-Нукпеза Т. и др.(2014) Nedd9 сдерживает почечный цистогенез у мышей Pkd1 – / -. Proc Natl Acad Sci U S A
  111: 12859–12864. 10.1073 / pnas.1405362111 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Pan J, Snell W (2007) Первичная ресничка: хранитель ключа к клеточному делению. Клетка
  129: 1255–1257. 10.1016 / j.cell.2007.06.018 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Pazour GJ. (2004) Внутрилагегеллярный транспорт и цилиозависимое заболевание почек: цилиарная гипотеза поликистозной болезни почек.J Am Soc Nephrol
  15: 2528–2536. 10.1097 / 01.asn.0000141055.57643.e0 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Pazour GJ, Baker SA, Deane JA, Cole DG, Dickert BL, Rosenbaum JL, Witman GB, Besharse JC (2002a) Внутрилагеллярный транспорт белок IFT88 необходим для сборки и поддержания фоторецепторов позвоночных. J Cell Biol
  157: 103–113. 10.1083 / jcb.200107108 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Pazour GJ, Rosenbaum JL (2002) Внутрилагаличный транспорт и заболевания, зависящие от ресничек.Тенденции Cell Biol
  12: 551–555. 10.1016 / s0962-8924 (02) 02410-8 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Pazour GJ, San Agustin JT, Follit JA, Rosenbaum JL, Witman GB (2002b) Полицистин-2 локализуется в ресничках почек и уровень ресничек повышен у мышей orpk с поликистозом почек. Curr Biol
  12: R378 – R380. 10.1016 / s0960-9822 (02) 00877-1 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Phua SC, Chiba S, Suzuki M, Su E, Roberson EC, Pusapati GV, Setou M, Rohatgi R, Reiter JF, Икегами К. и др.(2017) Динамическое ремоделирование мембранного состава запускает клеточный цикл за счет удаления первичных ресничек. Клетка
  168: 264–279.e15. 10.1016 / j.cell.2016.12.032 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Piontek K, Menezes LF, Garcia-Gonzalez MA, Huso DL, Germino GG (2007) Критический переключатель развития определяет кинетика образования кисты почки после потери Pkd1. Нат Мед
  13: 1490–1495. 10.1038 / nm1675 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Плотникова О.В., Никонова А.С., Лоскутов Ю.В., Козюлина П.Ю., Пугачева Е.Н., Големис Е.А. (2012) Активация кальмодулином киназы Aurora-A (AURKA) требуется во время разборки ресничек и митозов.Клетка Mol Biol
  23: 2658–2670. 10.1091 / mbc.e11-12-1056 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Плотникова О.В., Пугачева Е.Н., Данбрак Р.Л., Големис Е.А. (2010) Быстрая кальций-зависимая активация киназы Aurora-A . Nat Commun
  1: 64
  10.1038 / ncomms1061 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Pugacheva EN, Jablonski SA, Hartman TR, Henske EP, Golemis EA (2007) HEF1-зависимая активация Aurora A вызывает разборку первичной реснички. Клетка
  129: 1351–1363.10.1016 / j.cell.2007.04.035 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Reynolds DM, Hayashi T., Cai Y, Veldhuisen B, Watnick TJ, Lens XM, Mochizuki T, Qian F, Маэда Й., Ли Л. и др. (1999) Аберрантный сплайсинг гена PKD2 как причина поликистозной болезни почек. J Am Soc Nephrol
  10: 2342–2351. [PubMed] [Google Scholar]
• Sanchez I, Dynlacht BD (2016) Сборка и разборка ресничек. Nat Cell Biol
  18: 711–717. 10.1038 / ncb3370 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Schneider L, Clement CA, Teilmann SC, Pazour GJ, Hoffmann EK, Satir P, Christensen ST (2005) Передача сигналов PDGFRalphaalpha регулируется через первичный реснички в фибробластах.Curr Biol
  15: 1861–1866. 10.1016 / j.cub.2005.09.012 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Shao X, Somlo S, Igarashi P (2002) Эпителиально-специфическая рекомбинация Cre / lox в развивающихся почках и мочеполовых путях. J Am Soc Nephrol
  13: 1837–1846. 10.1097 / 01.asn.0000016444..50 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Shibazaki S, Yu Z, Nishio S, Tian X, Thomson RB, Mitobe M, Louvi A, Velazquez H, Ishibe S, Cantley LG , и другие. (2008) Формирование кист и активация внеклеточного регулируемого пути киназы после специфической инактивации почек Pkd1.Хум Мол Генет
  17: 1505–1516. 10.1093 / hmg / ddn039 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Шницар И., Башкуров М., Массон Г.Р., Огунджими А.А., Мосесиан С., Кабеза Е.А., Хирш К.Л., Трка Д., Гиш Дж., Цзяо J, et al. (2015) PTEN регулирует реснички через растрепанные. Nat Commun
  6: 8388
  10.1038 / ncomms9388 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Sung CH, Leroux MR (2013) Роли эволюционно законсервированных функциональных модулей в связанном с ресничками трафике.Nat Cell Biol
  15: 1387–1397. 10.1038 / ncb2888 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Sung CH, Li A (2011) Ресорбция ресничек модулирует длину G1 и прогрессию клеточного цикла. Клеточный цикл
  10: 2825–2826. 10.4161 / cc.10.17.16943 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Walz G. (2017) Роль первичных ресничек в неделящихся и постмитотических клетках. Клеточная ткань Res
  369: 11–25. 10.1007 / s00441-017-2599-7 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Wang L, Dynlacht BD (2018) Регулирование сборки и разборки ресничек при развитии и заболевании.Разработка
  145: dev151407
  10.1242 / dev.151407 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Wong SY, Seol AD, So PL, Ermilov AN, Bichakjian CK, Epstein EH Jr, Dlugosz AA, Reiter JF (2009) Primary реснички могут как опосредовать, так и подавлять зависимый от пути hedgehog туморогенез. Нат Мед
  15: 1055–1061. 10.1038 / нм.2011 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Wong YL, Anzola JV, Davis RL, Yoon M, Motamedi A, Kroll A, Seo CP, Hsia JE, Kim SK, Mitchell JW и др.(2015) Клеточная биология. Обратимое истощение центриолей ингибитором поло-подобной киназы 4. Наука
  348: 1155–1160. 10.1126 / science.aaa5111 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Xia S, Li X, Johnson T, Seidel C, Wallace DP, Li R (2010) Полицистин-зависимое зондирование потока жидкости нацелено на гистон деацетилаза 5 для предотвращения развития кист почек. Разработка
  137: 1075–1084. 10.1242 / dev.049437 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Xu J, Li H, Wang B, Xu Y, Yang J, Zhang X, Harten SK, Shukla D, Maxwell PH, Pei D, et al.(2010) Инактивация VHL индуцирует HEF1 и киназу Aurora A. J Am Soc Nephrol
  21: 2041–2046. 10.1681 / asn.2010040345 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Yeh C, Li A, Chuang JZ, Saito M, Caceres A, Sung CH (2013) IGF-1 активирует локализованную ресничку неканонический путь передачи сигналов Gbetagamma, который регулирует развитие клеточного цикла. Dev Cell
  26: 358–368. 10.1016 / j.devcel.2013.07.014 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Yoder BK, Hou X, Guay-Woodford LM (2002) Белки поликистозной болезни почек, полицистин-1, полицистин -2, полярис и цистин совместно локализуются в почечных ресничках.J Am Soc Nephrol
  13: 2508–2516. 10.1097 / 01.asn.0000029587.47950.25 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Zheng W, Cai R, Hofmann L, Nesin V, Hu Q, Long W, Fatehi M, Liu X, Hussein S, Kong T , и другие. (2018) Прямое связывание между пре-S1 и TRP-подобными доменами в каналах TRPP опосредует стробирование и функциональную регуляцию с помощью PIP2. Сотовый представитель
  22: 1560–1573. 10.1016 / j.celrep.2018.01.042 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Zhou J. (2009) Полицистины и первичные реснички: праймеры для развития клеточного цикла.Анну Рев физиол
  71: 83–113. 10.1146 / annurev.physiol.70.113006.100621 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Русская Ривьера | The New Yorker

При строжайшем секрете Эмиль сказал Кости, что с ним покончено с Советским Союзом.

«Так получилось, – сказал Эмиль, – что мой отец был евреем». Смеясь, он добавил: «Трудно поверить, что это принесет мне что-нибудь, кроме больших неприятностей».

Год спустя Эмиль сел в поезд и ушел. Он обещал Косте открытку, откуда бы он ни приземлился.Он пообещал перевезти его на Запад, где его природные дары будут вознаграждены. Костя ждал открытку, но она так и не пришла. Постепенно он отклонился от режима тренировок. Больше времени проводил с друзьями с мебельной фабрики, ходил в баню , , пил немного, общался с женщинами. Иногда Костя, чувствуя позывы в спине и плечах, возвращался в спортзал, но оказавшись там, почувствовал себя гостем. Люди узнавали его лицо, но все меньше и меньше запоминали его имя.

Так, как и все, Костя прожил свою жизнь. Он смотрел Олимпийские игры в Сеуле по телевизору и испытывал лишь мимолетное сожаление. Он оставался на мебельной фабрике, пока она не была куплена консорциумом немцев и шведов. После этого он занялся доступным ему видом работы: физическим трудом, часто на открытом воздухе. Письмо от Эмиля он получил, когда работал на лесозаготовительной бригаде в окружении таких же людей, как он сам – анонимных многих, которым не удавалось преуспеть в новой России.На конверте был адрес Торонто. В письме Эмиль извинился за то, что не писал шесть лет, но предложил выполнить свое обещание привести Кости в свободный мир. В письме были конкретные инструкции и чек на девятьсот американских долларов.

На двенадцать лет позже запланированного Костя поехал поездом из Омска в Москву – только теперь его пунктом назначения была не Олимпийская деревня, а туристическое агентство. Отчасти потому, что перуанцы не требовали визу, Костя купил билет на самолет до Лимы.Оставшуюся часть денег он отдал старухе, которая утверждала, что является тетей Эмиля. Она дала ему подушку и шерстяное одеяло и помогла ему придвинуть журнальный столик к стене ее гостиной. Костя пробыл с ней три ночи, пока его рейс не улетел в Перу. Большинство других пассажиров в самолете были русскими, и Костя задумался, у скольких из них были те же намерения, что и у него. Казалось странным, что столько россиян захотят поехать в Перу. На его взгляд, почти все они выглядели подозрительно.Он предположил, что тоже выглядел подозрительно, и боялся, что кто-то из пассажиров или стюардесса доносит на него. Но когда самолет приземлился на стыковку в Гандере, Ньюфаундленд, Кости пригласили выйти вместе со всеми.

К его удивлению, все произошло именно так, как написал Эмиль. Он проследовал за очередью пассажиров по длинному коридору и оказался внутри терминала. Он выбрал стул в самой удаленной части зала и просмотрел содержимое своей сумки через плечо.В самом низу он нашел свои кроссовки. Изо всех сил стараясь скрыть то, что он делает, он снял стельку со своего правого ботинка и поднес клочок бумаги, который спрятал там. Затем он перепаковал свою сумку и прошел по полу терминала, пока не увидел то, что искал. Возле газетного киоска стояла женщина в униформе. Костя не знал, что означает форма, но выглядело она официально. Собравшись вперёд, словно для пресловутого прыжка в холодную воду, Костя подошел к женщине и стал читать с клочка в руке.

«Я ем беженец», – сказал Костя.

Опровергнув все его разумные ожидания, женщина ответила на русском с сильным акцентом.

«Вы хотите статус беженца?»

«Да», – сказал Костя.

«Следуй за мной», – приказала она.

Костя провел две недели в приюте для беженцев в Гандере, прежде чем его забрал отец Никита, священник русской православной церкви, который содержал приют для русских беженцев в Торонто. Когда он прибыл в дом, Эмиль был там, чтобы поприветствовать его.В ту же ночь Костя переехал в однокомнатную квартиру Эмиля в северной части города. Здание было занято в основном русскими, по бокам стояли другие здания, занятые другими русскими. Многие из этих русских тоже были евреями, хотя Костя особо не видел разницы. На главной улице были русские деликатесы, русские книжные магазины, русские видеомагазины и даже вывески и плакаты на русском языке, прикрепленные к автобусным остановкам и телефонным столбам. В ближайшем парке и на детской площадке Костя слышал как русский язык, так и английский.Для Кости нерусский мир существовал только в различных спортзалах, куда Эмиль водил его на тренировки. Но даже там от Кости редко требовалось общаться какими-либо способами, кроме самых грубых. Он выучил английскую лексику бокса: джеб, кросс, хук, скольжение, апперкот. Также пригодилось слово «ОК».

Вскоре после того, как Костя поселился, Эмиль отвез его на встречу с их благодетелем. Они совершили короткую поездку на минивэне Эмиля, в котором он много лет доставлял пиццу.

«Не разговаривайте, если вам не нужно», – сказал Эмиль.«И что бы я ни говорил, не противоречите мне».

Человек, которого они должны были встретить, был Бомка Гольдфарб. До распада Советского Союза Бомка продавал недвижимость в Торонто, но после распада он вернулся в свой родной Киев и заработал состояние, торгуя марганцем. Он был одним из самых богатых русских иммигрантов в Торонто.

Бомка назначил встречу не в своем офисе, а в новом русском ресторане, к которому он имел частичный интерес. Ресторан находился в нескольких минутах от квартиры Эмиля, в торговом центре.Эмиль слышал, что на нем был огромный фонтан в фойе.

Фонтан, как объяснил Бомка Гольдфарб, приветствуя их, был копией того, что он видел в Риме. Когда он инвестировал в ресторан, это было при условии, что в нем будет такой фонтан. Фонтан представлял собой мраморную скульптуру. Он доходил почти до потолка и состоял из четырех рыб, поддерживающих туловище мощного человека. Похоже, что мужчина пил из большой раковины или дул в нее.В глазах Кости лицо мужчины было похоже на лицо Бомки Гольдфарба.

Бомка подвела их к столу у широкой сцены, на которой стояло блестящее белое пианино. Он велел им подождать, а через несколько мгновений вернулся в сопровождении худощавого человека с морщинистым лицом.

«Это, – сказал Бомка, – мой напарник, Зяма Карп. Ресторан – это его видение ».

Бомка села за стол, а Зяма остался стоять.

«Зяма, – сказал Бомка, – ты должен познакомиться с этими людьми.Константин Петров, чемпион по боксу, и его тренер, старший советский тренер Эмиль Осипович Штенберг ».

«Чемпион по боксу?» – спросила Зяма.

«Очень талантливый», – сказал Бомка. «Эмиль подошел ко мне и сказал:« Хотели бы вы инвестировать в боксера? »Я думал о скаковой лошади. Но Эмиль сказал: «Боксер дешевле и интереснее лошади». Он будет драться на Трамп-Плаза, как только мы наладим его иммиграционный контроль ».

«Где ты был чемпионом по боксу?» – спросила Зяма.

«В Сибири», – сказал Эмиль. «В 1984 году он бы уехал в Лос-Анджелес, если бы не бойкот».

«Должно быть, вы были очень разочарованы», – сказал Зяма.

«Вы не представляете, – сказал Эмиль.

«Я разговаривал с ним», – сказал Зяма.

«Это разочаровало нас обоих, – сказал Эмиль.

«Что с ним? Он не может говорить?

«Конечно, он может говорить», – сказал Эмиль.

«Когда ты станешь интереснее лошади?» – спросила Зяма.

«Какая лошадь?» – сказал Костя.

«Мне нравится чувство юмора, – сказал Зяма.

Встреча завершилась новым обещанием Бомки ускорить иммиграционный процесс Кости. У него были лучшие юристы. У них были очень хорошие связи. По его словам, если их спросят, они могут получить убежище для Сталина.

По дороге домой Эмиль был в очень приподнятом настроении. Не раз он добровольно заявлял, что доволен результатами встречи.

«Вы произвели хорошее впечатление», – сказал Эмиль.

«Почему ты сказал, что я чемпион?»

«Это слово понимает кто-то вроде Бомки Гольдфарб».

«Он будет разочарован. Я уже не тот боец, которым был шесть лет назад, – сказал Костя.

«Ты лучше, чем думаешь», – сказал Эмиль. «Большинство американских боксеров не подходят для завязывания ботинок».

«А если бы вы написали мне шесть лет назад», – сказал Костя.

«Шесть лет назад я разносил пиццу. А когда я не разносил пиццу, я охранял вестибюль кондоминиума.Так что я должен был тебе написать? «Дорогой Костя, у меня нет денег. В боксерском учреждении ко мне относятся как к помехе. Здесь никого не волнует, живу я или умру »? Что бы вы сделали с таким письмом? ”

Костя подумал, что такое письмо ему бы понравилось. Это ничего бы не изменило, но, подумав о письме, он увидел его на аккуратном кухонном столе, где его мать оставила бы его. Он видел себя вечером, после фабрики, сидящим с письмом в руках.Он представлял себя в том прошлом. Было приятно получить известие от Эмиля, прочитать о его проблемах. Приятно было думать, что в далекой стране у него был друг, который его помнил.

Иветта никогда не встречалась с Эмилем, но у нее было о нем мнение. Еще у нее было мнение о Бомке Гольдфарб и Скинни Зяме. Ее злило, что такие люди обманывают Кости, и злило то, что он позволял себя обмануть.

«Бомка давала заверения, а юристы – заверения. Эмиль им доверял, а я – Эмилю », – сказал Костя.

«Кто в здравом уме поверит такому человеку, как Бомка Гольдфарб?»

«Он заплатил Эмилю, чтобы он привез меня.